Introducción
HiPure HP Plant RNA Mini Kit (R4165) está diseñado para extraer ARN de muestras vegetales con alto contenido de inhibidores, en las que los flujos estándar basados en columnas o guanidina suelen producir un bajo rendimiento o una pureza reducida.
El flujo de trabajo integra lisis basada en CTAB, extracción orgánica y digestión con DNasa en columna para mejorar la recuperación de ARN de tejidos vegetales difíciles, como plantas leñosas, hojas maduras y muestras ricas en inhibidores.
Además de la purificación de ARN total, el sistema permite recuperar fracciones de ARN pequeño, lo que facilita aplicaciones como el análisis de microARN en matrices vegetales complejas.
Dentro de la gama de ARN vegetal de Magen, R4165 actúa como la solución específica para muestras vegetales difíciles, y complementa a R4150 para muestras rutinarias y de tipo desconocido.
Detalles
Flujo de trabajo
Descripción general del flujo de trabajo
HiPure HP Plant RNA Mini Kit utiliza un flujo de trabajo en columna basado en CTAB para la purificación de ARN total, incluido miARN, a partir de muestras vegetales y de hongos difíciles. Después de la molienda con nitrógeno líquido, la muestra se lisa con Buffer PAL en presencia de 2-mercaptoetanol; para muestras complejas ricas en polifenoles puede añadirse PVP-40. A continuación, se utiliza Buffer BDP o una extracción con cloroformo para separar los residuos vegetales, las proteínas, los complejos formados entre CTAB y contaminantes, y otros materiales interferentes de la fase acuosa que contiene los ácidos nucleicos. La fase acuosa se ajusta con Buffer GXP2 o, para una recuperación que incluya miARN, con isopropanol, y posteriormente se carga en la columna de ARN. El ARN unido se lava, se somete a digestión con DNasa en columna, se seca y se eluye con agua libre de RNasas.
Lógica de manipulación de las muestras
Este flujo de trabajo está diseñado para muestras vegetales y de hongos en las que los polisacáridos, polifenoles, pigmentos u otros contaminantes de origen vegetal pueden interferir con la purificación directa del ARN. La lisis con CTAB/PAL y la etapa de separación de fases mediante BDP o cloroformo proporcionan una ruta previa de separación de contaminantes antes de establecer las condiciones de unión del ARN. La cantidad de muestra, la eficacia de la molienda, la viscosidad del lisado y la cantidad de material floculento formado después de preparar las condiciones de unión deben controlarse cuidadosamente, especialmente en tejidos difíciles. Una vez transferida la fase acuosa y ajustadas las condiciones de unión, la purificación posterior sigue el flujo de trabajo universal en columna con digestión integrada de DNasa en columna.
Tiempo y características del flujo de trabajo
En condiciones habituales de procesamiento manual, el flujo de trabajo suele completarse en aproximadamente 70–80 minutos, dependiendo principalmente de la disrupción de la muestra, el comportamiento durante la lisis, la separación de fases, la viscosidad del lisado y la etapa de digestión con DNasa en columna de 20 minutos. Esta ruta es adecuada para laboratorios que requieren un flujo de trabajo de extracción de ARN vegetal basado en CTAB con un control más eficaz de contaminantes y la posibilidad de recuperar también miARN. Para consultar las condiciones detalladas paso a paso, las recomendaciones del flujo de trabajo y los tiempos estimados de procesamiento, consulte la Nota del flujo de trabajo en la sección de descargas.
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Funciones principales
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Aislamiento de ARN total, incluido miARN, a partir de menos de 200 mg de muestras vegetales difíciles de extraer, utilizando un sustituto del cloroformo de menor toxicidad
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Aplicaciones
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RT-PCR, qPCR, hibridación Northern, secuenciación de nueva generación, ensayos de protección de ácidos nucleicos y traducción in vitro
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Método de purificación
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Minicolumna de centrifugación
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Tecnología de purificación
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Tecnología de sílice
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Método de procesamiento
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Manual, mediante centrifugación o vacío
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Tipo de muestra
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Muestras vegetales difíciles de extraer, como frutos, semillas, hojas de vid y hojas de té
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Cantidad de muestra
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≤200 mg
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Volumen de elución
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≥30 µL
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Tiempo por procesamiento
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Aproximadamente 70–80 minutos
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Capacidad de carga líquida por columna
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800 µL
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Capacidad de unión de la columna
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100 µg
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Características de ingeniería
Lisis basada en CTAB para tejidos vegetales ricos en inhibidores
Mejora la liberación del ARN y reduce la coextracción de polisacáridos y polifenoles en muestras vegetales difíciles.
Estrategia flexible de extracción orgánica
Permite utilizar cloroformo o el reactivo específico BDP con rendimientos y pureza del ARN comparables, proporcionando una alternativa a los flujos de trabajo tradicionales basados en disolventes orgánicos.
Compatibilidad con ARN pequeño bajo condiciones optimizadas
La química de unión puede ajustarse para retener especies de ARN de bajo peso molecular, lo que permite recuperar tanto ARN total como miARN de muestras vegetales complejas.
Digestión con DNasa en columna
Favorece la eliminación de la contaminación por ADN genómico en muestras ricas en inhibidores.
Mayor tolerancia a las impurezas
Adaptado para matrices vegetales en las que los flujos de trabajo estándar presentan un rendimiento reducido.
Validación técnica
HiPure HP Plant RNA Mini Kit se evaluó como un flujo de trabajo de extracción de ARN basado en CTAB para muestras vegetales difíciles que no se procesan adecuadamente con kits convencionales de ARN vegetal. El flujo de trabajo combina lisis vegetal de tipo CTAB, limpieza con Buffer BDP, purificación mediante columna de sílice y digestión con DNasa I en columna, y está diseñado para muestras vegetales que contienen concentraciones elevadas de polisacáridos, polifenoles, pigmentos, proteínas u otros inhibidores de la extracción.
Buffer BDP se evaluó como tampón de limpieza sustitutivo del cloroformo utilizando alícuotas de lisado de hojas de soja preparadas a partir de 300 mg de material foliar. En las condiciones evaluadas, las muestras tratadas con BDP mostraron una recuperación y pureza de ácidos nucleicos comparables a las muestras tratadas con cloroformo. El tratamiento con cloroformo produjo rendimientos de ácidos nucleicos de 13,38–14,93 µg por alícuota de lisado procesada, mientras que los cuatro lotes de BDP evaluados produjeron rendimientos de 12,81–15,03 µg. Las muestras tratadas con BDP mantuvieron valores A260/280 de aproximadamente 2,14–2,15 y valores A260/230 de 2,23–2,31, sin diferencias evidentes entre lotes dentro del intervalo evaluado.
El análisis por electroforesis no mostró diferencias evidentes entre las muestras tratadas con cloroformo y las tratadas con BDP. Los lisados tratados con BDP también produjeron sobrenadantes transparentes sin arrastre visible de pigmentos, lo que respalda una eliminación eficaz de pigmentos, proteínas y otras impurezas derivadas de la lisis. Estos resultados indican que Buffer BDP puede proporcionar una capacidad de limpieza similar a la del cloroformo, al tiempo que reduce la dependencia de la manipulación de cloroformo de alta toxicidad en la extracción de ARN vegetal basada en CTAB.
El kit también se evaluó con materiales vegetales difíciles, incluidos hojas de abedul, tejido de callo de manzano y hojas de bambú Bashan. A partir de 50–100 mg de tejido vegetal difícil se recuperó ARN satisfactoriamente de estas muestras complejas, con valores RIN representativos de aproximadamente 4,9–8,6, dependiendo del tipo de muestra y del estado del tejido. Ensayos comparativos adicionales con hojas de yuca, calabaza, tomate y pimiento mostraron que el flujo de trabajo PAL/BDP de tipo CTAB produjo cantidades medibles de ARN, con valores A260/280 generalmente situados entre 1,93 y 2,18 y valores A260/230 entre 1,92 y 2,21 en las condiciones evaluadas.
En conjunto, estos resultados respaldan el uso de R4165 como una solución especializada basada en CTAB para la extracción de ARN de muestras vegetales difíciles, especialmente cuando los kits convencionales de ARN vegetal presentan bajo rendimiento, obstrucción de la columna, arrastre de pigmentos o contaminación por inhibidores. La inclusión de digestión con DNasa I favorece además su uso en aplicaciones posteriores sensibles al fondo de ADN genómico, mientras que la etapa de limpieza basada en BDP proporciona una alternativa de menor toxicidad a la extracción dependiente de cloroformo para muestras vegetales complejas.
Kit Contents
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Contents
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R416502
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R416503
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Purification Times
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50 Preps
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250 Preps
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HiPure RNA Mini Columns
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50
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250
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2ml Collection Tubes
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50
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250
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DNase I
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600 μl
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5 x 600 μl
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DNase Buffer
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6 ml
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30 ml
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Buffer PAL
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60 ml
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270 ml
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Buffer GXP2*
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20 ml
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100 ml
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Buffer BDP
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60 ml
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270 ml
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Buffer RWC*
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20 ml
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75 ml
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Buffer RW2*
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20 ml
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2 x 50 ml
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RNase Free Water
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10 ml
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30 ml
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Storage and Stability
DNase I should be stored at -20°C upon arrival. However, short-term storage (up to 12 weeks) at room temperature (15–25°C) does not affect their performance. The remaining kit components can be stored dry at room temperature (15–25°C) and are stable for at least 18 months under these conditions. The entire kit can be stored at 2–8°C, but in this case buffers should be redissolved before use. Make sure that all buffers are at room temperature when used.
