Ⅰ. Tecnología y aplicaciones
mNGS
· Definición:
La secuenciación metagenómica de nueva generación (mNGS) es un método de secuenciación de alto rendimiento que analiza directamente todas las secuencias de ácidos nucleicos de una muestra sin necesidad de definir previamente las secuencias diana. Permite analizar bacterias, virus, hongos y parásitos en un mismo ensayo.
· Aplicaciones en el estudio de infecciones:
Permite detectar patógenos poco frecuentes, emergentes y asociados a infecciones mixtas, y contribuye a abordar la complejidad y los tiempos prolongados de la identificación de patógenos en pacientes inmunodeprimidos. Estos pacientes presentan mayor susceptibilidad a las infecciones y coinfecciones, así como una respuesta de anticuerpos débil que puede limitar los métodos de detección inmunológica.
Además, la mNGS tiene un gran potencial para la tipificación de cepas, la detección de genes de virulencia y resistencia, la vigilancia de infecciones hospitalarias y el seguimiento de brotes de enfermedades infecciosas en la comunidad. Puede aportar información sobre los agentes causales para apoyar el diagnóstico y el tratamiento clínicos.
tNGS
· Definición:
La secuenciación dirigida de nueva generación (tNGS) consiste en enriquecer y amplificar las secuencias diana de ácidos nucleicos presentes en una muestra antes de preparar la biblioteca y realizar la secuenciación de alto rendimiento.
· Aplicaciones en el estudio de infecciones:
La tNGS permite obtener más información en un solo ensayo, lo que facilita la detección de coinfecciones e infecciones complejas. También permite detectar patógenos presentes en cantidades muy bajas o que se detectan con poca frecuencia mediante métodos convencionales.
La tNGS tiene potencial de aplicación clínica en la detección de patógenos y la identificación de resistencias a los tratamientos. Se ha utilizado para la detección y la evaluación de resistencias en Mycobacterium tuberculosis, el virus de la gripe A y el citomegalovirus.
Ⅱ. Comparación entre mNGS y tNGS
① Características técnicas:
mNGS:
Secuenciación de todas las secuencias de ácidos nucleicos presentes en la muestra analizada.
tNGS:
Secuenciación dirigida de genes específicos presentes en la muestra analizada.
② Ventajas:
mNGS:
La detección precisa de toda la información genética de la muestra mejora la capacidad para identificar patógenos poco frecuentes y desconocidos.
tNGS:
No se ve afectada por el genoma humano y presenta un coste de análisis reducido.
③ Limitaciones:
mNGS:
Puede verse afectada por secuencias del hospedador y por señales bacterianas de fondo. Por sí sola, no permite distinguir entre microorganismos causantes de infección y microorganismos colonizadores.
tNGS:
Depende del diseño de cientos o miles de sondas de oligonucleótidos. El proceso de enriquecimiento puede introducir contaminación y el alcance de detección es limitado, por lo que no permite detectar nuevos patógenos que no estén incluidos en el diseño.
④ Flujo de trabajo:
mNGS:
Los requisitos técnicos de la mNGS son relativamente bajos, pero requiere un análisis bioinformático complejo.
tNGS:
El flujo de trabajo de la tNGS requiere más tiempo y reactivos para preparar la biblioteca, pero simplifica el análisis bioinformático.
⑤ Tiempo y coste:
mNGS:
Mayor tiempo de procesamiento (24–36 horas) y coste elevado.
tNGS:
Menor tiempo de procesamiento (8–16 horas) y coste más bajo.
⑥ Aplicaciones clínicas:
mNGS:
Tiene utilidad clínica en la detección de patógenos poco frecuentes o emergentes y en casos de infección por múltiples patógenos.
tNGS:
Mejora la capacidad de detección de patógenos intracelulares y hongos, así como de virus de ARN, como el causante de la COVID-19.
⑦ Áreas de mejora:
mNGS:
Es necesario mejorar la calidad de las lecturas de secuenciación y optimizar la preparación de bibliotecas para reducir la pérdida de detección de bacterias con alto contenido de GC.
tNGS:
Es necesario seguir optimizando el conjunto de cebadores y sus proporciones para reducir la interferencia de los dímeros de cebadores.
Ⅲ. Resumen y discusión
En pacientes con infecciones complejas y difíciles de caracterizar, o con infecciones por patógenos emergentes, se recomienda la mNGS para la detección de patógenos. Cuando existe una sospecha clara de un patógeno concreto, la tNGS puede utilizarse como apoyo diagnóstico.
También pueden combinarse varios métodos de forma simultánea o secuencial. Por ejemplo, la mNGS puede utilizarse para obtener las secuencias iniciales de nuevos patógenos, y la PCR o la tNGS para realizar una evaluación posterior.
Kits de Magen para la extracción de ADN/ARN de patógenos para NGS:
| N.º DE CATÁLOGO | NOMBRE DEL PRODUCTO | PRESENTACIÓN | PRECIO | Aplicación |
| R6672B | MagPure Pathogen DNA/RNA Kit B | 96 preparaciones | $439.00 |
Extracción de ARN/ADN de patógenos a partir de 0,5 mL de muestras con bajo contenido celular o acelulares.
Recomendado para aplicaciones de tNGS.
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| R6672C | MagPure Pathogen DNA/RNA Enrich Kit | 96 preparaciones | $760.00 |
Extracción de ARN/ADN de patógenos a partir de 0,5–1,5 mL de muestras, como sangre total y líquidos corporales.
Recomendado para aplicaciones de mNGS/tNGS.
Enriquecimiento de ácidos nucleicos totales de patógenos y eliminación de ácidos nucleicos de fondo del hospedador.
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