Preparación de muestras de sangre para análisis molecular

Seleccione rutas de preparación de muestras de sangre de Magen para ADN de sangre total, ARN sanguíneo, ARN/miRNA, cfDNA plasmático, ADN/ARN circulante y extracción de ácidos nucleicos virales y de patógenos.

Guía técnica de rutas para sangre total, capa leucocitaria, plasma y suero

1.0 La muestra de sangre no corresponde a un único flujo de trabajo

Las muestras relacionadas con sangre suelen agruparse en las listas de productos, pero no se comportan como una sola matriz de extracción. La sangre total, la capa leucocitaria, el plasma y el suero pueden proceder de la misma extracción sanguínea, pero contienen componentes biológicos diferentes cuando entran en un flujo de trabajo de extracción. Por tanto, la primera pregunta no es solo si la muestra es sangre, sino qué fracción sanguínea se va a procesar y dónde se localiza el ácido nucleico diana.

Esta distinción es práctica. Una muestra de sangre total anticoagulada puede procesarse directamente, o separarse antes de la extracción en plasma y capa leucocitaria. Una vez tomada esa decisión, el problema de extracción cambia. La sangre total y la capa leucocitaria son rutas celulares, mientras que el plasma y el suero son rutas líquidas con bajo contenido celular. Un flujo de trabajo para ADN o ARN de sangre total no equivale a un flujo de trabajo para cfDNA plasmático, ARN circulante o ácidos nucleicos virales.

La función de la preparación de muestras es hacer técnicamente posible la pregunta posterior. La PCR pregunta principalmente si se han eliminado los inhibidores y si la diana puede recuperarse. La WGS requiere ADN genómico del hospedador intacto y consistente. La RT-qPCR y el análisis de expresión añaden el problema de la estabilidad del ARN. La tNGS y la mNGS añaden el fondo de reactivos, el fondo del hospedador, la disrupción microbiana y la compatibilidad con la preparación de bibliotecas. Estas diferencias determinan la ruta.

2.0 Primero la fracción sanguínea: material de partida, diana y lógica de ruta

La tabla siguiente sirve como mapa de rutas para flujos de trabajo moleculares relacionados con sangre. No sustituye los protocolos específicos de cada producto; ayuda al laboratorio a decidir qué tipo de sistema de extracción debe considerarse antes de seleccionar un número de catálogo.

3.0 ADN genómico del hospedador a partir de sangre total y células derivadas de sangre

La extracción de ADN genómico de sangre total se dirige principalmente al ADN del hospedador procedente de células sanguíneas nucleadas, especialmente leucocitos. Los eritrocitos maduros de mamíferos no son la fuente principal de ADN genómico. El problema técnico no es solo liberar ADN, sino hacerlo en una matriz que contiene hemoglobina, proteínas plasmáticas, anticoagulantes y otros componentes que pueden afectar a los ensayos enzimáticos.

HiPure Blood DNA Mini Kit (D3111) representa la ruta basada en columna. Procesa sangre total, plasma, suero, capa leucocitaria, médula ósea, fluidos corporales, linfocitos y células cultivadas. El flujo de trabajo utiliza digestión con Proteinase K, unión a membrana de sílice, lavados y elución. Esta ruta es útil cuando las prioridades son el control manual, la flexibilidad de entrada y ADN genómico rutinario compatible con PCR.

La capa leucocitaria es útil cuando el objetivo es enriquecer ADN genómico derivado de leucocitos. Es una fracción enriquecida en leucocitos preparada a partir de sangre total y puede aportar varias veces más entrada de ADN que el mismo volumen de sangre total. La contrapartida es que la preparación de capa leucocitaria añade fraccionamiento manual y puede introducir variación entre operadores, mientras que los flujos de trabajo directos de sangre total reducen la manipulación inicial.

MagPure Blood DNA Kit (D6311) representa la ruta de perlas magnéticas para laboratorios que necesitan extracción automatizada basada en placas o de 96 canales. Es compatible con sangre total, plasma, suero, capa leucocitaria, fluidos corporales, linfocitos y células cultivadas. MagPure Fast Blood DNA Kit (D6310C) representa una ruta magnética más rápida para sangre, saliva, solución de inmersión de hisopos, homogenizado, solución digestiva y suspensión celular, con compatibilidad para instrumentos de extracción de 16/32/48 canales.

Algunos flujos de trabajo de ADN sanguíneo dan más importancia a la longitud de fragmento que a la recuperación rutinaria de ADN compatible con PCR. Cuando la aplicación posterior requiere ADN genómico de alto peso molecular, la ruta de extracción debe minimizar el cizallamiento innecesario sin dejar de eliminar proteínas, ARN e inhibidores enzimáticos. Este requisito es distinto de la preparación estándar de ADN de sangre para PCR, genotipado de lectura corta o qPCR rutinaria.

MagPure Universal HW DNA Kit (D6381) representa la ruta magnética para ADN de alto peso molecular. Utiliza Proteinase K y lisis basada en SDS seguida de purificación con partículas magnéticas, y admite sangre, capa leucocitaria, médula ósea y otras muestras biológicas cuando se requieren fragmentos de ADN más largos. Esta ruta es útil cuando el laboratorio desea un flujo de trabajo magnético para NGS, secuenciación de tercera generación, secuenciación de lectura larga Oxford Nanopore / PacBio, análisis de variantes estructurales u otros análisis donde la integridad del ADN y la longitud de fragmento forman parte del requisito del método.

SolPure Blood DNA Kit (D3311) representa la ruta de precipitación salina para ADN sanguíneo de alto peso molecular. El flujo de trabajo elimina primero el fondo de eritrocitos, lisa los leucocitos con un detergente aniónico en presencia de un estabilizador de ADN, digiere el ARN, elimina proteínas por precipitación salina y recupera ADN genómico por precipitación con alcohol. Esta ruta es útil cuando la prioridad es la recuperación escalable de ADN genómico más largo a partir de sangre total, capa leucocitaria, médula ósea o fluidos corporales para secuenciación de tercera generación, lectura larga, análisis de variantes estructurales, haplotipado, análisis posteriores sensibles o archivo de ADN.

Las rutas de ADN universal también merecen una mención breve porque algunos flujos de trabajo relacionados con sangre no se limitan a la extracción clásica de ADN sanguíneo. HiPure Universal DNA Kit (D3018) y MagPure Universal DNA Kit (IVD3102) se entienden mejor como sistemas de ADN compatibles con una amplia gama de muestras. Son útiles cuando el laboratorio procesa sangre junto con tejidos, células, hisopos u otras muestras biológicas y desea una misma familia de flujos de trabajo de ADN para tipos de muestra relacionados. Sin embargo, no deben tratarse como flujos de trabajo de cfDNA o ARN sanguíneo.

La lógica de selección es, por tanto, una lógica de ruta. Utilice una ruta de columna cuando importen el control manual y la flexibilidad en lotes pequeños; utilice una ruta magnética cuando importen la automatización y la consistencia en placa; considere la capa leucocitaria cuando se desee enriquecer ADN leucocitario. Cuando el método posterior requiera fragmentos de ADN genómico más largos para secuenciación de tercera generación, lectura larga, análisis de variantes estructurales o archivo genómico, seleccione una ruta de alto peso molecular en lugar de un flujo rutinario de ADN sanguíneo. Las rutas universales de ADN siguen siendo útiles cuando la sangre es solo una parte de un flujo de trabajo biológico más amplio.

4.0 ARN sanguíneo, coextracción de ARN/miRNA y rutas de ARN circulante

Los flujos de trabajo de ARN requieren un nivel diferente de control. La extracción de ADN puede tolerar a menudo retrasos moderados o variación de muestra; la extracción de ARN está más expuesta a las condiciones de toma, actividad de RNasas, almacenamiento, descongelación y química de lisis inicial. Por tanto, un método de ARN sanguíneo debe evaluarse por el estado de muestra para el que está diseñado, no solo por si la matriz final de unión es una columna o una perla magnética.

HiPure Blood RNA Mini Kit (R4161) representa una ruta de columna para ARN de sangre total. Su flujo de trabajo lisa selectivamente los eritrocitos, recoge los leucocitos por centrifugación y después lisa los leucocitos en condiciones altamente desnaturalizantes para inactivar RNasas antes de la purificación en columna. No equivale a centrifugar simplemente el plasma. La lisis de eritrocitos se utiliza para reducir el fondo eritrocitario y estandarizar la recuperación de ARN leucocitario.

MagPure Blood RNA Kit (R6611) representa una ruta magnética automatizada para sangre anticoagulada, linfocitos, capa leucocitaria, médula ósea, células cultivadas y muestras relacionadas. También empieza con reducción del fondo eritrocitario al procesar sangre total, y luego utiliza unión magnética y tratamiento con DNasa. Esta ruta es adecuada cuando importan el procesamiento por lotes, el control con DNasa y la consistencia automatizada.

Dos rutas especiales de ARN sanguíneo deben mantenerse visibles sin sobrecargar la página. HiPure Paxigene Blood RNA Kit (R4168) se ajusta a flujos de trabajo de ARN de sangre total estabilizada procedente de tubos de recogida tipo PAXgene, mientras que MagPure Blood RNA Kit Ⅱ (R6613) se ajusta a sangre congelada, capa leucocitaria y médula ósea, donde el historial de almacenamiento y la celularidad pueden variar. Su lógica de lisis basada en MagZol es más adecuada para muestras almacenadas difíciles que tratarlas como sangre fresca rutinaria.

MagPure Blood RNA Kit C (R6611C) añade una distinción importante: está diseñado para ARN total incluyendo microRNA a partir de sangre, capa leucocitaria, médula ósea, suspensión celular y otros fluidos corporales. Utiliza un flujo de trabajo magnético de pequeño volumen con tratamiento con DNasa y debe mantenerse separado de los flujos de trabajo de miRNA circulante de suero/plasma.

Los flujos de trabajo de ARN circulante de suero y plasma deben tratarse como rutas de fracción líquida con bajo contenido celular. MagPure Serum miRNA Kit (R6628) está diseñado para suero y plasma, usando desnaturalización, precipitación de proteínas y purificación con perlas magnéticas para recuperar ARN total incluyendo ARN pequeño. R4163 y R4314 pertenecen ambos a la familia de ARN y miRNA de suero/plasma, pero responden a preferencias de manejo distintas. HiPure Liquid RNA (miRNA) Kit (R4163) utiliza una ruta MagZol + columna de centrifugación para una lisis fenol–guanidina más fuerte y una recuperación máxima de ARN / microRNA a partir de muestras líquidas, mientras que HiPure Serum miRNA Kit (R4314) ofrece una ruta de columna sin fenol basada en precipitación de proteínas y purificación en membrana de sílice para flujos de trabajo más rápidos de miRNA de suero/plasma. Cuando la diana es ADN/ARN circulante combinado, R4316 proporciona una ruta separada de ADN/ARN libre de células, no una ruta de ARN de sangre total.

La distinción clave es celular frente a libre de células. Los flujos de trabajo de sangre total, capa leucocitaria y médula ósea recuperan principalmente ARN celular, y algunas rutas pueden incluir microRNA. Los flujos de trabajo de plasma y suero se dirigen a especies de ARN circulante, miRNA o ADN/ARN circulante combinado en la fracción líquida.

5.0 Rutas de ADN/ARN libre de células en plasma y suero

Los flujos de trabajo de ácidos nucleicos libres de células en plasma y suero forman una rama separada de la preparación de muestras de sangre. A diferencia de la extracción de ADN genómico de sangre total o ARN celular, estos flujos empiezan por fracciones líquidas con bajo contenido celular y se dirigen a ácidos nucleicos extracelulares fragmentados y de baja abundancia.

Para flujos centrados en cfDNA, Magen ofrece rutas basadas en columna y en perlas magnéticas, como HiPure Circulating DNA Kit (IVD3182) y MagPure Circulating DNA Maxi Kit (IVD5435). Cuando se requiere recuperación combinada de ADN/ARN circulante, R4316 proporciona una ruta de columna para suero, plasma u otras muestras líquidas libres de células, incluyendo ADN/ARN circulante y miRNA.

Los kits centrados en cfDNA, los kits de ARN-miRNA de suero/plasma y los kits combinados de ADN/ARN circulante parten todos de fracciones líquidas con bajo contenido celular, pero se seleccionan según si el flujo prioriza recuperación solo de ADN, recuperación de ARN / miRNA o recuperación combinada de ADN/ARN.

Para selección detallada de productos cfDNA, diseño de flujo de trabajo y orientación de aplicaciones, consulte los recursos dedicados de Magen sobre cfDNA.

6.0 Ácidos nucleicos virales y de patógenos a partir de muestras relacionadas con sangre

La extracción de ácidos nucleicos virales y de patógenos a partir de muestras relacionadas con sangre debe interpretarse según la fracción de muestra y el objetivo posterior. Los flujos virales de suero y plasma (IVD4173, IVD4175, IVD5412) suelen seguir una ruta líquida con bajo contenido celular, centrada en recuperación de ADN/ARN viral de baja copia y compatibilidad con PCR / RT-PCR. Los flujos de patógenos relacionados con sangre pueden requerir extracción directa de patógenos, preparación de baja carga de fondo o reducción del fondo del hospedador según si el ensayo posterior es PCR, tNGS o mNGS.

Dentro de los flujos de patógenos, MagPure Pathogen DNA/RNA Kit (IVD6672) se ajusta a la extracción directa de ADN/ARN de patógenos para flujos rutinarios orientados a PCR o qPCR. MagPure Pathogen DNA/RNA Kit B (R6672B) se ajusta a la extracción directa de baja carga de fondo para tNGS o aplicaciones de paneles de patógenos. MagPure Pathogen DNA/RNA Enrich Kit (R6672C) y HiPure Pathogen DNA/RNA Kit (IVD4179) entran en una lógica de enriquecimiento cuando se requiere reducción del fondo del hospedador y preservación de la señal del patógeno para muestras orientadas a mNGS.

IVD4179 es útil aquí como ejemplo de lógica de ruta en preparación de muestras de sangre. No es un flujo de lisis de eritrocitos ni un kit simple de ADN/ARN de sangre total. La fracción líquida puede contener material viral, asociado a micoplasma u otro material relacionado con patógenos de bajo contenido celular, mientras que la fracción sedimentada puede contener células del hospedador, restos de células sanguíneas y bacterias u hongos asociados al sedimento. El flujo conserva la fracción líquida con bajo contenido celular mientras procesa la fracción sedimentada para control del fondo del hospedador y liberación microbiana antes de la purificación en columna.

Para selección a nivel de producto y lógica detallada de flujo de trabajo, consulte la Guía de selección de kits para extracción de ácidos nucleicos virales y de patógenos y el artículo Magen Viral / Pathogen Workflows Explained.

7.0 Orientación por aplicación para flujos de trabajo relacionados con sangre

Los ejemplos de aplicación son útiles cuando aclaran la función de la ruta de muestra. La tabla siguiente resume las direcciones de aplicación por ruta de extracción. La sección posterior utiliza ejemplos seleccionados de estudios publicados para mostrar cómo aparecen las muestras derivadas de sangre en contextos experimentales reales.

7.1 Ejemplos seleccionados de aplicaciones relacionadas con sangre en estudios publicados

Los ejemplos siguientes ilustran funciones de muestra, lógica de ruta de extracción y contextos de aplicación posterior en flujos de trabajo publicados. Deben leerse como referencias de aplicación, no como afirmaciones de validación específicas de producto para cada ruta.

El primer grupo se centra en ADN celular de sangre. En estos estudios, el ADN de sangre total, capa leucocitaria o leucocitos proporciona una capa germinal o normal pareada para la interpretación de secuenciación.

WGS y multiómica a escala de cohorte

En estudios de WGS y multiómica a escala de cohorte, el ADN de sangre o capa leucocitaria aporta la capa genómica del hospedador. En el estudio multiómico de adultos chinos, el ADN derivado de sangre se utilizó para secuenciación del genoma del hospedador, mientras que otras capas de datos incluyeron metagenómica intestinal, metabolitos sanguíneos y fenotipos clínicos. Por tanto, la extracción debía proporcionar ADNg consistente, adecuado para llamada de variantes a gran escala y comparación entre muestras. En este contexto, la extracción de ADN sanguíneo no es solo un paso de preparación antes de la secuenciación; soporta la capa de referencia genómica utilizada para asociación con microbioma, integración de metabolitos e interpretación multiómica.

WGS familiar y análisis de variantes de novo

La WGS familiar utiliza ADN de sangre periférica de probandos y familiares para soportar el análisis de herencia. En el estudio de secuenciación de tríos en TEA, se recogieron muestras de sangre periférica de miembros del núcleo familiar para secuenciación de alto rendimiento y filtrado posterior de variantes. El método depende de ADN germinal fiable de cada familiar, porque la llamada de variantes de novo requiere comparar al hijo con los padres. Por tanto, la ruta de extracción debe soportar ADN estable de calidad WGS antes de la comprobación de relaciones familiares, el modelado de herencia y la interpretación de patogenicidad.

ADN sanguíneo para análisis de enfermedades hereditarias y genes de susceptibilidad

El ADN de sangre periférica también se utiliza cuando un estudio se centra en un gen, una vía o un locus de susceptibilidad definidos. En el estudio de cardiopatía congénita cianótica, se extrajo ADN de sangre periférica y se utilizó para secuenciación del gen EGLN1, incluyendo UTR, exones y región promotora aguas arriba. La pregunta posterior no era descubrimiento genómico amplio, sino interpretación genotipo–fenotipo relacionada con la respuesta hipóxica y la vía PHD2 / HIF-1A. Este tipo de flujo requiere calidad de ADN adecuada para secuenciación dirigida y análisis genético confirmatorio, no solo detección rutinaria por PCR.

Secuenciación farmacogenómica dirigida a HLA

La secuenciación farmacogenómica dirigida a HLA impone una demanda específica a la extracción de ADN sanguíneo. En el caso de insuficiencia hepática inducida por albendazol, se extrajo ADN genómico de muestras de sangre periférica, se enriqueció la región HLA y se secuenció en plataforma NovaSeq. El análisis posterior se centró en la interpretación de alelos HLA en el contexto de riesgo de lesión hepática inducida por fármacos. Aquí, la extracción debe soportar la preparación de bibliotecas basada en captura y secuenciación de alta profundidad en una región altamente polimórfica, donde la resolución a nivel de alelo es más importante que la simple recuperación de ADN.

Control sanguíneo pareado en perfilado genómico tumoral

En el perfilado genómico tumoral, el ADN de leucocitos derivado de sangre puede actuar como control normal pareado en lugar de ser la muestra principal de enfermedad. En el estudio de reordenamiento complejo de ALK en NSCLC, las muestras tumorales se analizaron mediante NGS basada en ADN, NGS basada en ARN, FISH e IHC, mientras que el ADN de leucocitos proporcionó el fondo germinal para la interpretación. Esta función puede pasarse por alto fácilmente: la muestra de sangre no se utiliza para detectar directamente la alteración tumoral, sino para ayudar a separar eventos somáticos tumorales de señales de fondo heredadas. Por tanto, una ruta estable de ADN sanguíneo es importante cuando deben resolverse reordenamientos complejos, variantes de baja frecuencia o ambigüedades de análisis solo tumoral.

El ejemplo siguiente conecta dos rutas derivadas de sangre en un mismo flujo: ADN celular de sangre y cfDNA plasmático.

ADN sanguíneo pareado y cfDNA plasmático en flujos MRD informados por tumor

Los flujos MRD informados por tumor utilizan muestras relacionadas con sangre en más de una función. En el estudio de monitorización posoperatoria de ctDNA en NSCLC, el ADN pareado de tumor y leucocitos se utilizó para diseñar un ensayo personalizado basado en WES, mientras que muestras seriadas de cfDNA plasmático se utilizaron para vigilancia longitudinal de MRD tras cirugía. Son capas de preparación conectadas pero distintas. El ADN celular derivado de sangre soporta la interpretación normal pareada y el diseño de panel personalizado; la extracción de cfDNA plasmático debe recuperar ctDNA de baja abundancia desde una fracción líquida libre de células para monitorización de recurrencia y seguimiento posoperatorio de enfermedad.

Los últimos ejemplos pasan del ADN celular al ARN y a rutas de fracción líquida libre de células, donde la estabilidad del ARN, la recuperación de ARN pequeño y la clarificación del plasma son más importantes que el rendimiento de ADN genómico.

ARN sanguíneo y secuenciación de circRNA a partir de sangre periférica estabilizada

El ARN de sangre periférica puede soportar descubrimiento de biomarcadores a nivel transcriptómico cuando la recogida y el almacenamiento están controlados. En un estudio de fractura vertebral por compresión osteoporótica senil, se recogió sangre periférica fresca en tubos EDTA, se estabilizó con Magen RNASafer™ LS Reagent, se almacenó a -80 °C y se extrajo usando Hipure PX Blood RNA Mini Kit. El ARN se comprobó con Qubit y Agilent 2100 antes de secuenciación Illumina HiSeq XTen. El análisis posterior identificó circRNAs diferencialmente expresados, predijo vías relacionadas y redes circRNA–miRNA–mRNA, y validó circRNAs seleccionados mediante qRT-PCR. Por tanto, la ruta de extracción debía preservar información de expresión, no solo recuperar ARN medible.

Perfilado de cfRNA plasmático para análisis de infección y respuesta del hospedador

El perfilado de cfRNA plasmático utiliza la fracción líquida libre de células para estudiar la respuesta del hospedador y señales relacionadas con patógenos. En un estudio de cfRNA en COVID-19, se recogió sangre total en tubos EDTA, el plasma se separó mediante centrifugación en dos pasos y el ARN se extrajo inmediatamente con HiPure Liquid RNA Mini Kit. El cfRNA se utilizó para construcción de bibliotecas PALM-seq y secuenciación DNBSEQ, permitiendo analizar señales de mRNA, lncRNA, miRNA, tRNA y ARN microbiano. El análisis posterior identificó biomarcadores de cfRNA asociados a COVID-19, patrones inflamatorios y antivirales, regulación por ARN no codificante, cambios en el pool de tRNA y perfiles microbianos plasmáticos. Este ejemplo se incluye aquí porque la ruta de extracción empieza desde plasma como fracción de ARN libre de células; no debe interpretarse como un flujo de enriquecimiento directo de patógenos a partir de una muestra rica en hospedador.

Análisis de miRNA plasmático en investigación de biopsia líquida relacionada con cáncer

Los estudios de miRNA plasmático utilizan sangre como muestra líquida con bajo contenido celular, no como muestra celular sanguínea. En un estudio de cáncer de vejiga, se recogió sangre total de pacientes con cáncer de vejiga, controles con enfermedad benigna e individuos sanos, seguida de clarificación plasmática en dos pasos para eliminar células residuales y detritos. El plasma libre de células se mezcló con MagZol LS Reagent antes de la extracción de ARN, y el ARN recuperado incluyendo miRNA se utilizó para análisis por qRT-PCR de miR-145 circulante. Este tipo de aplicación requiere recuperación de especies de ARN de baja abundancia desde una matriz rica en proteínas, manteniendo la compatibilidad con el análisis de expresión posterior.

8.0 Notas finales

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