Tecnología y principios
Dificultades de la extracción de ácidos nucleicos: una visión multidimensional de las limitaciones del objetivo, la muestra y la matriz
La extracción de ácidos nucleicos puede fallar por razones muy diferentes: el objetivo puede estar diluido, la cantidad de muestra disponible puede ser limitada, los ácidos nucleicos del hospedador pueden predominar sobre el objetivo, las moléculas pueden ser excepcionalmente cortas o largas, la fijación puede haberlas alterado o la matriz de la muestra puede interferir con la purificación. Este artículo analiza estas dimensiones por separado y muestra cómo los flujos de trabajo de Magen modifican la secuencia de extracción para abordar cada una de ellas.
1. Limitaciones relacionadas con la cantidad: concentración y cantidad total disponible
La baja concentración y una cantidad total limitada suelen agruparse bajo el concepto de ácidos nucleicos en cantidades traza, pero requieren estrategias diferentes. El cfDNA plasmático está diluido, aunque a menudo puede procesarse un mayor volumen de plasma y concentrarse el ADN recuperado. En cambio, una muestra forense puede no ofrecer material adicional, por lo que aumentar el volumen de líquido no incrementa el número de moléculas objetivo disponibles para la recuperación.
Extracción de cfDNA de gran volumen: objetivo diluido y cantidad de entrada escalable
MagPure Circulating DNA Maxi Kit (IVD5435) está diseñado para abordar este problema de gran volumen. Con volúmenes de entrada de 1–4 ml, el lisado entra directamente en contacto con partículas magnéticas de alta capacidad de unión en condiciones caotrópicas. Con volúmenes de 5–8 ml, el lisado se divide y la misma fracción de partículas se expone secuencialmente a ambas porciones antes del lavado; de este modo, el cfDNA recuperado del mayor volumen inicial permanece en una sola fracción de partículas y puede eluirse en un volumen final mucho menor. Los lavados repetidos a base de guanidina y etanol eliminan el fondo adicional procedente del plasma, mientras que el ARN portador puede utilizarse para reducir la pérdida de ácidos nucleicos poco abundantes por adsorción a las superficies de los consumibles.
Extracción de ADN forense: material limitado y liberación difícil
El material forense suele ser limitado desde el origen, y matrices difíciles como huesos, dientes, cabello y uñas pueden hacer que la liberación del ADN sea tan importante como la posterior etapa de unión.
MagPure Forensic DNA Kit (D6359D) comienza adaptando la digestión a la matriz, en lugar de procesar todas las muestras como si fueran el mismo lisado. El material óseo y dental utiliza una ruta específica con BGL, mientras que el cabello, las uñas, las manchas de semen, los tejidos y otras muestras relacionadas se someten a una digestión basada en ATL; ambas rutas combinan DTT con proteinasa K. En los materiales mineralizados, el protocolo también presta especial atención a la molienda fina y a limitar el calentamiento durante la disrupción mecánica, ya que el ADN no puede recuperarse eficazmente hasta que las células incluidas en la matriz sean accesibles a la digestión. La digestión puede prolongarse cuando sea necesario, tras lo cual se eliminan los residuos no digeridos.
Solo entonces la muestra pasa a la purificación magnética. El ADN liberado se captura con MagPure Particles N en condiciones de unión BST1, se somete a lavados secuenciales y se eluye en un volumen reducido. Los protocolos automatizados pueden utilizar la unión en uno o dos pocillos cuando una matriz difícil requiere una mayor exposición a las condiciones de unión. En este caso, la secuencia es determinante: primero hacer accesible el ADN y después recuperarlo.
ADN genómico y ARN total de muestras habituales como caso de referencia
En los flujos de trabajo convencionales para tejidos, sangre y células cultivadas, la cantidad del objetivo no suele ser la principal limitación. MagPure Universal DNA Kit (IVD3102) sigue por ello una secuencia directa de lisis asistida por proteinasa K, unión magnética en condiciones caotrópicas, lavado y elución, sin añadir una etapa de enriquecimiento o concentración.
HiPure Total RNA Plus Kit (R4111) aborda el arrastre de ADN genómico durante la preparación de ARN total. El lisado pasa primero por una columna de eliminación de ADN; posteriormente se añade etanol al líquido que atraviesa la columna y el ARN se captura en una membrana de sílice independiente.
2. Relación entre el objetivo y el fondo: extracción de ácidos nucleicos de patógenos
MagPure Viral DNA/RNA Kit (IVD5412) está diseñado para la recuperación directa de ácidos nucleicos virales a partir de suero, plasma, soluciones de remojo, sobrenadantes de homogeneizados de tejido y otras muestras sin células o con bajo contenido celular. La proteinasa K y el ARN portador, la química de unión caotrópica, la captura magnética y los lavados a base de etanol permiten recuperar una amplia variedad de ADN/ARN viral sin una etapa de reducción del material del hospedador.
Las muestras con abundante material del hospedador requieren un enfoque diferente. MagPure Pathogen DNA/RNA Enrich Kit (R6672C) separa primero el sobrenadante que contiene los virus de la fracción celular, lisa preferentemente las células eucariotas y utiliza DNasa para digerir el ADN liberado del hospedador mientras se retienen las células microbianas. A continuación, la fracción microbiana se somete a disrupción mecánica y se trata con proteinasa K antes de la purificación magnética de ADN/ARN. El flujo de trabajo modifica la relación entre el objetivo y el fondo antes de la unión final, en lugar de intentar resolver la interferencia del hospedador durante la etapa de purificación con partículas.
3. Tamaño molecular: ARN pequeño y ADN de alto peso molecular
miARN y otras moléculas pequeñas de ARN
Las especies de ARN muy cortas no se comportan como los ARN de mayor tamaño en todas las condiciones de unión a sílice. HiPure Universal miRNA Kit (R4310) utiliza una lisis basada en fenol y guanidina seguida de una unión controlada mediante alcohol. Para obtener ARN total, incluido el miARN, la fase acuosa se ajusta directamente para la captura en sílice. Para el fraccionamiento por tamaño, una menor concentración de alcohol permite unir primero los ARN de más de aproximadamente 200 nt, mientras que los ARN pequeños permanecen en el líquido que atraviesa la columna; posteriormente se añade más etanol para que la fracción enriquecida en miARN pueda unirse a una segunda columna.
En las muestras sin células, HiPure Serum/Plasma miRNA Kit (R4314) combina la lisis caotrópica con la precipitación selectiva de proteínas antes de mezclar el sobrenadante clarificado con isopropanol acidificado y cargarlo sobre sílice. La eliminación de gran parte de la carga proteica antes de la unión permite adaptar el flujo de trabajo para ARN pequeño a suero, plasma, orina y otros líquidos relacionados; puede añadirse un tratamiento con DNasa en columna cuando sea necesario eliminar el ADN residual.
ADN de alto peso molecular
El ADN de alto peso molecular presenta el requisito opuesto: el rendimiento es importante, pero también lo es conservar las moléculas largas. MagPure Universal HW DNA Kit (D6381) utiliza una lisis enzimática con SDS controlada, seguida de unión y lavado magnéticos, con una homogeneización relativamente suave del tejido, inversiones repetidas durante la lisis y una alteración mínima de las partículas durante el lavado final. La purificación magnética también evita forzar el ADN largo a atravesar la membrana de una columna de centrifugación. La manipulación de la muestra sigue siendo una posible fuente de fragmentación, pero el flujo de trabajo elimina una limitación mecánica adicional para aplicaciones con ADN de alto peso molecular, como la secuenciación Nanopore.
4. Integridad molecular: extracción de ADN/ARN de muestras FFPE
Las muestras FFPE pueden contener abundante material celular y seguir siendo difíciles de procesar porque la fijación modifica los propios ácidos nucleicos.
MagPure FFPE DNA/RNA Kit (R6327) comienza con la eliminación de la parafina, la digestión con proteinasa K y una incubación controlada a 90 °C destinada a revertir parcialmente las modificaciones inducidas por el formaldehído. El protocolo también advierte que un tratamiento más prolongado o a mayor temperatura puede aumentar la fragmentación del ADN, por lo que la etapa de reversión se mantiene deliberadamente dentro de unos límites definidos.
Tras el pretratamiento, el kit separa el ADN y el ARN mediante adsorción magnética secuencial. El ADN se captura primero con MagPure Particles N en condiciones BST1, mientras que el ARN permanece en el sobrenadante. Después, este sobrenadante se transfiere a una segunda etapa de unión en la que se utilizan isopropanol y MagBind Particles para capturar la fracción de ARN. Finalmente, el ADN y el ARN se lavan y eluyen por separado.
5. Química de la matriz: extracción de ADN y ARN vegetal
ADN vegetal: eliminar los componentes de la matriz antes de la unión a sílice
El tejido vegetal puede contener abundante ADN genómico, pero los polisacáridos, polifenoles, pigmentos y otros componentes coextraídos pueden dificultar la purificación del lisado. HiPure HP Plant DNA Kit (D3187) controla gran parte de esa química antes de la unión a sílice: tras la lisis basada en CTAB se realiza una extracción con cloroformo, con condiciones reductoras adicionales, PVP-40 para materiales ricos en polifenoles y una extracción orgánica adicional opcional para muestras especialmente difíciles con un alto contenido de polifenoles o almidón.
ARN vegetal: control de la matriz y conservación del ARN
En la extracción de ARN vegetal, la oxidación y la actividad de las nucleasas se suman al mismo problema de la matriz. HiPure Plant RNA Plus Kit (R4150) utiliza TCEP o, como alternativa, 2-mercaptoetanol durante la lisis para reforzar las condiciones reductoras y limitar la actividad de las nucleasas y la oxidación de los polifenoles. A continuación, el lisado clarificado pasa por un filtro de ADN genómico antes del ajuste con etanol y la captura en una columna de sílice independiente para ARN.
6. Limitaciones combinadas: extracción de ADN/ARN libre de células
Algunas muestras combinan varias de estas limitaciones. El ARN libre de células, por ejemplo, puede estar diluido, enriquecido en fragmentos cortos y ser sensible a la degradación, además de requerir una concentración final.
HiPure Circulating DNA/RNA Kit (R4316) está diseñado para procesar 1–5 ml de suero, plasma y otros líquidos sin células. El flujo de trabajo comienza con una precipitación selectiva de proteínas mediada por sales metálicas para reducir la carga de proteínas plasmáticas antes de la purificación con sílice. A continuación, la muestra procesada se carga en una columna Viral Midi de mayor capacidad para realizar una primera captura conjunta de los ácidos nucleicos procedentes del volumen intermedio. Tras el lavado, los ácidos nucleicos se eluyen de esta primera columna y vuelven a unirse a una columna RNA Micro más pequeña, que proporciona una segunda etapa de concentración antes de la elución final en un volumen reducido.
Una de las rutas copurifica ADN y ARN libres de células, incluido el miARN; la otra incorpora DNasa en la etapa de la microcolumna cuando se requiere ARN sin ADN. Ambas comparten la misma estructura básica de captura conjunta seguida de reconcentración en microcolumna.
7. Cómo modifican el flujo de trabajo las distintas limitaciones
| Limitación dominante | Aspecto que debe controlar el flujo de trabajo | Ejemplo de Magen | Mecanismo utilizado |
|---|---|---|---|
| ADN genómico de muestras habituales | Lisis, eliminación de contaminantes y recuperación magnética reproducible | IVD3102 | Lisis con proteinasa K → unión magnética caotrópica → lavados repetidos → elución |
| ARN total de muestras habituales con riesgo de arrastre de ADN genómico | Recuperación de ARN con reducción de la contaminación por ADN genómico | R4111 | Columna de eliminación de ADN → ajuste con etanol → columna independiente de unión de ARN |
| cfDNA de baja concentración con cantidad de entrada escalable | Captura y concentración a partir de grandes volúmenes | IVD5435 | Partículas magnéticas de alta capacidad de unión → unión secuencial para 5–8 ml → elución en volumen reducido |
| Material forense limitado y matriz difícil | Liberación del ADN antes de la recuperación magnética con pérdidas reducidas | D6359D | Digestión BGL/ATL específica para la matriz + DTT/proteinasa K → captura magnética → exposición prolongada opcional a las condiciones de unión |
| Baja relación entre patógeno y hospedador | Reducción del fondo del hospedador antes de la extracción final | R6672C | Lisis de células del hospedador → digestión con DNasa del ADN liberado del hospedador → disrupción microbiana → purificación magnética de ADN/ARN |
| Especies de ARN cortas | Retención o fraccionamiento de miARN y otros ARN pequeños | R4310; R4314 | Fraccionamiento por tamaño controlado mediante alcohol; o precipitación de proteínas seguida de captura en sílice del ARN pequeño libre de células |
| Integridad del ADN de fragmentos largos | Purificación de ADN de alto peso molecular con una manipulación mecánica innecesaria mínima | D6381 | Lisis enzimática con SDS controlada → unión y lavado magnéticos → elución templada sin paso a través de membrana |
| Modificación molecular asociada a la fijación | Recuperación de ADN y ARN tras el pretratamiento de muestras FFPE | R6327 | Desparafinado + proteólisis + reversión térmica controlada → primera captura magnética de ADN → segunda captura de ARN |
| Matriz vegetal compleja | Eliminación de polisacáridos, polifenoles y otros componentes coextraídos antes de la unión | D3187 | Lisis con CTAB → extracción orgánica → tratamiento opcional con PVP/agente reductor → unión a sílice |
| Matriz de ARN vegetal + riesgo de oxidación y actividad de RNasas | Protección del ARN y eliminación del ADN genómico antes de la purificación final | R4150 | Lisis reductora con TCEP/2-ME → filtro de ADN genómico → columna de sílice para ARN |
| Limitaciones combinadas en muestras sin células | Eliminación de proteínas, captura de volumen intermedio, reconcentración y eliminación opcional del ADN | R4316 | Precipitación selectiva de proteínas → captura conjunta en columna Midi → reconcentración en columna Micro → ruta opcional con DNasa |
La cuestión útil no es si una muestra es simplemente «fácil» o «difícil», sino en qué punto de la secuencia de extracción empieza a comportarse de forma diferente. Una vez identificada esa etapa limitante, también suele quedar claro por qué es necesario modificar la estrategia de lisis, pretratamiento, unión, fraccionamiento o concentración.