Preparación de muestras para la extracción de ADN y ARN:
Guía práctica de pretratamiento
Identifique el tipo de muestra y, a continuación, elija el ácido nucleico que desea extraer. Las tablas presentan cantidades de muestra, volúmenes de reactivos, condiciones de centrifugación y etapas esenciales de digestión o incubación representativas. Primero se indican los métodos habituales y, debajo, los tratamientos especiales.
Elija la fracción antes de elegir el tratamiento. El ADN o ARN celular, los ácidos nucleicos libres de células y los ácidos nucleicos de patógenos pueden requerir preparaciones distintas a partir de una misma muestra. Compruebe si el objetivo se encuentra en el sedimento, en el líquido o en ambos. El PBS y la solución salina dispersan las muestras; no sustituyen a un reactivo de lisis.
Uso de los ejemplos: Las cantidades corresponden al protocolo de Magen indicado y a sus reactivos preparados. Para una muestra no incluida, considere tanto la matriz como el objetivo, confirme la compatibilidad con el kit seleccionado y pruebe primero con una pequeña cantidad. Estos ejemplos incluyen las etapas esenciales de lisis, digestión y clarificación, pero omiten la unión, el lavado y la elución habituales de los ácidos nucleicos. Siga las instrucciones del kit para la purificación posterior. La centrifugación se expresa como fuerza centrífuga relativa (× g); las rpm se utilizan únicamente para la agitación o la molienda. RT significa temperatura ambiente.
Índice rápido por tipo de muestra
- 1. Sangre: Sangre total y capa leucocitaria; lisis directa o eliminación de eritrocitos según el objetivo de extracción.
- 2. Plasma y suero: ADN libre de células, ARN libre de células, incluido el miARN, ácidos nucleicos virales y ácidos nucleicos asociados a vesículas extracelulares.
- 3. Tejidos animales: Tejidos animales habituales y tejidos de insectos; preparación para obtener ADN, ARN, ADN de alto peso molecular o ácidos nucleicos de patógenos.
- 4. Tejidos FFPE: Cortes de tejido fijado en formalina e incluido en parafina; ADN, ARN o recuperación por separado de ambos a partir de una misma muestra.
- 5. Células cultivadas: Células en suspensión y adherentes; recolección celular o lisis directa.
- 6. Otras muestras clínicas: Orina, líquido amniótico, saliva, hisopos, esputo, líquido de lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo y líquido ascítico.
- 7. Tejidos vegetales: Tejidos vegetales frescos, congelados o secos; matrices vegetales habituales, ricas en polifenoles y otras matrices difíciles.
- 8. Muestras de bacterias, levaduras y hongos: Cultivos microbianos y material fúngico; preparación para obtener ADN genómico, ARN o ADN plasmídico.
- 9. Heces y suelo: Muestras de heces y suelo; extracción de ADN o coextracción de ADN/ARN con control de inhibidores.
- 10. Muestras de alimentos: Alimentos sólidos habituales y procesados, alimentos semisólidos y aceites alimentarios.
- 11. Materiales de muestras forenses: Manchas de sangre, manchas de semen, pelo, uñas, huesos y dientes.
1. Sangre
Estos ejemplos se aplican a sangre humana o de otros mamíferos. La sangre que contiene eritrocitos nucleados requiere instrucciones específicas sobre la cantidad de muestra y la lisis.
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN: lisis directa de sangre total | Coloque 20 µL de Proteinase K en un tubo, añada 200 µL de sangre total anticoagulada, a continuación, añada 200 µL de Buffer AL. Mezcle bien e incube a 70°C durante 10 min.Ejemplo: D3111. | Utilice la alícuota de sangre total. Este método no requiere la eliminación previa de eritrocitos (RBC). |
| ADN: preparación de la capa leucocitaria | Centrifugue la sangre total anticoagulada a 2,500 × g durante 10 min a RT. Recoja la capa leucocitaria situada entre el plasma y la capa de eritrocitos. Utilice hasta 200 µL; ajuste las alícuotas menores a 200 µL con PBS. Añada 20 µL de Proteinase K y 200 µL de Buffer AL, mezcle e incube a 70°C durante 10 min.Ejemplo: D3111. | Conserve la capa leucocitaria. Esta concentra las células nucleadas, por lo que debe controlar tanto la carga celular como el volumen de líquido. |
| ARN leucocitario: eliminación de eritrocitos | Añada 5 mL de 1× Buffer RBC a 1 mL de sangre total. Incube en hielo durante 10–15 min, mezclando brevemente dos veces. Centrifugue a 400 × g durante 10 min a 4°C; deseche el sobrenadante. Resuspenda en 2 mL de 1× Buffer RBC y repita la centrifugación. Retire el líquido por completo, disgregue el sedimento y añada 0.7 mL de RTL Lysis Buffer. Mezcle y, a continuación, pase el lisado al menos cinco veces a través de una aguja roma de calibre 20 acoplada a una jeringa libre de RNasa.Ejemplo: R4161. | Conserve el sedimento leucocitario. Así se selecciona ARN enriquecido en leucocitos. La proporción de RBC, la temperatura y la centrifugación difieren de las del ejemplo de ADN anterior. |
| ARN de sangre total: lisis directa | Coloque 7 mL de MagZol BD3 en un tubo de 15 mL y añada 5 mL de sangre anticoagulada. Agite inmediatamente de forma enérgica durante 15 s, a continuación, agite en vórtex durante 15 s. Incube a 60°C durante 10 min.Ejemplo: R4164, protocolo Midi B para ARN de sangre. | Utilice la alícuota de sangre total y el reactivo específico para ARN de sangre. Este ejemplo corresponde a sangre no congelada; la sangre congelada tiene condiciones de preparación específicas. |
2. Plasma y suero
Prepare el plasma o el suero mediante condiciones de recolección y separación adecuadas para el ensayo previsto. Evite el arrastre de células sanguíneas cuando el objetivo sean ácidos nucleicos libres de células.
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN circulante | Combine 200 µL de Proteinase K, 2 mL de plasma o suero, 1.6 mL de Buffer ACL y 5 µL de solución preparada de Carrier RNA (1 µg). Mezcle bien e incube a 60°C durante 30 min.Ejemplo: IVD3182. | Conserve el líquido. Un método de sedimentación celular seleccionaría una fracción objetivo diferente. |
| ARN libre de células, incluido el miARN | Tras la separación inicial del plasma o el suero, centrifugue a 4,000–5,000 × g durante 15 min a 4°C y transfiera 1–5 mL de sobrenadante clarificado. Por cada 1 mL de muestra, añada 300 µL de Buffer CFL, agite bien en vórtex e incube a RT durante 10–15 min. Añada 100 µL de Buffer CFP por cada 1 mL de muestra original, agite enérgicamente en vórtex durante más de 20 s y coloque en hielo durante 3 min. Centrifugue a 13,000 × g durante 5 min o 4,000–5,000 × g durante 15 min.Ejemplo: R4316, protocolo 2. | Conserve el sobrenadante tras la precipitación de proteínas. Mezclar bien después de añadir CFP ayuda a evitar que los ácidos nucleicos queden atrapados en el precipitado. Para eliminar el ADN, utilice el tratamiento opcional posterior con DNase I. Para recuperar conjuntamente ADN libre de células y ARN, siga el protocolo 1. |
| ADN/ARN viral | Combine 20 µL de PK/Carrier RNA con 200 µL de plasma o suero. Añada 400 µL de Buffer VLE, agite en vórtex durante 15 s e incube a RT durante 5–10 min. Para alícuotas menores, complete la muestra hasta 200 µL con solución de cloruro de sodio al 0.9%.Ejemplo: IVD4175. | Utilice la alícuota líquida. Es esencial mezclar bien; este ejemplo no especifica una digestión independiente con calentamiento. |
| Ácidos nucleicos asociados a vesículas extracelulares | Centrifugue el suero a 2,000 × g durante 30 min a 4°C. Transfiera 0.8 mL de sobrenadante clarificado; añada 0.4 mL de Exosome Precipitation Solution e incube a 2–8°C durante 30 min. Centrifugue a 10,000 × g durante 10 min a RT. Retire el líquido; resuspenda el sedimento en 100 µL de PBS o agua estéril. Añada 20 µL de Proteinase K y 300 µL de Buffer GXP, mezcle e incube a RT durante 20 min.Ejemplo: R4319B, protocolo para suero. | Conserve el sedimento enriquecido mediante precipitación. La precipitación enriquece el material asociado a vesículas, pero no produce una población purificada de exosomas. |
3. Tejidos animales
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN, método habitual: corte y digestión | Corte <20 mg de tejido en fragmentos pequeños. Añada 250 µL de Buffer ATL y 20 µL de Proteinase K. Incube con agitación a 55°C durante 30–120 min, o toda la noche, hasta completar la digestión. Añada 250 µL de Buffer AL, mezcle e incube a 70°C durante 10 min.Ejemplo: D3018. | El corte seguido de digestión es suficiente para muchos tejidos; una homogeneización adecuada puede acortar la digestión. Cuando sea importante conservar fragmentos largos de ADN, controle el cizallamiento mecánico. |
| ARN, método habitual: disgregación en reactivo de lisis | Homogeneice 10–20 mg de tejido en 600 µL de RTL Lysis Buffer. Como alternativa, muela en nitrógeno líquido y añada el tampón al polvo antes de que se descongele. Centrifugue el lisado a 14,000 × g durante 3 min a RT.Ejemplo: IVD3020. | Conserve el lisado clarificado. Evite homogeneizar tejido fresco en PBS y dejarlo sin protección antes de la lisis para extraer ARN. |
| ADN de insectos: digestión prolongada | Corte <10 mg de tejido de insecto en fragmentos pequeños. Añada 250 µL de Buffer ITL y 20 µL de Proteinase K. Incube a 55°C durante 6 h o toda la noche, mezclando periódicamente. Si quedan partículas visibles sin digerir, centrifugue a 13,000 × g durante 3 min y transfiera el sobrenadante.Ejemplo: D3129. | Conserve el digerido o el sobrenadante clarificado. La molienda en nitrógeno líquido, la homogeneización o la molienda con microesferas pueden acortar la digestión. Para materiales difíciles, el manual permite añadir Proteinase K en dos porciones. |
| ADN de alto peso molecular: homogeneización controlada | Homogeneice lentamente 10–30 mg de tejido en 0.3 mL de Buffer ATL Minus con un homogeneizador de vidrio y cinco movimientos ascendentes y descendentes. Transfiera 0.25 mL de homogeneizado; añada 25 µL de Proteinase K y 18 µL de Buffer SDS. Mezcle por inversión; incube a 55°C durante 30–120 min o hasta completar la digestión. Si quedan residuos, centrifugue a 10,000 × g durante 3 min y transfiera 0.25 mL de sobrenadante. Añada 10 µL de RNase Solution, incube a RT durante 10–30 min, a continuación, añada 250 µL de Buffer AL e incube a 55°C durante 10 min.Ejemplo: D6381. | Equilibre la disgregación completa del tejido con la conservación de fragmentos largos de ADN. Utilice la química específica para ADN de alto peso molecular. |
| Ácidos nucleicos microbianos y virales: fraccionamiento | Homogeneice 50–100 mg de tejido en 1 mL de PBS o solución salina. Centrifugue a 13,000 × g durante 10 min. Conserve el sedimento para la vía microbiana y transfiera el sobrenadante a otro tubo para la vía viral. Continúe con la preparación de patógenos seleccionada, incluido el tratamiento para reducir el fondo del hospedador cuando se especifique.Ejemplo: IVD4179. | Conserve ambas fracciones cuando necesite las dos vías. Esta es una etapa de fraccionamiento, no una lisis microbiana completa. No separa de forma exclusiva todos los microorganismos de todos los virus. |
4. Tejidos FFPE
La desparafinización, la proteólisis y el tratamiento térmico son etapas independientes. Las condiciones para ADN y ARN que se indican a continuación pertenecen a protocolos diferentes y no deben intercambiarse. Los límites de cortes también dependen del área del tejido y de la capacidad del kit.
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN: desparafinización, digestión y tratamiento térmico | Retire el exceso de parafina y recoja hasta ocho cortes de 5–10 µm de espesor. Desparafinice con xileno o Buffer DPS según el procedimiento seleccionado. Añada 200 µL de Buffer ATL y 20 µL de Proteinase K al tejido preparado. Incube a 56°C durante 60 min, a continuación, a 90°C durante 60 min. Añada 200 µL de Buffer AL y mezcle.Ejemplo: D3018, protocolo para FFPE. | Conserve el tejido desparafinado. El tratamiento posterior a alta temperatura ayuda a revertir los entrecruzamientos y las modificaciones relacionados con la formalina; no restaura el ADN ya fragmentado durante la fijación. |
| ARN: desparafinización, digestión y tratamiento térmico | Recoja hasta ocho cortes de 5–20 µm de espesor. Añada 600 µL de Buffer DPS, agite en vórtex e incube a 56°C durante 3–5 min. Centrifugue a 14,000 × g durante 2 min; deseche el sobrenadante. Añada 150 µL de Buffer FRL y 20 µL de Proteinase K al sedimento. Incube a 55°C durante 15–30 min, a continuación, a 80°C durante 15 min. Añada 150 µL de Buffer AL y mezcle.Ejemplo: IVD3022. | Conserve el sedimento de tejido tras la desparafinización. Utilice las condiciones de tratamiento térmico especificadas para ARN; prolongarlo puede aumentar la fragmentación del ARN. La purificación posterior incluye un tratamiento con DNasa. |
| Recuperación por separado de ADN y ARN de una misma muestra | Tras el procedimiento de desparafinización de IVD5116, añada 180 µL de Buffer FRL y 20 µL de Proteinase K. Incube a 56°C durante 15 min, enfríe en hielo durante 3 min y centrifugue a 20,000 × g durante 15 min. Transfiera el sobrenadante para obtener ARN: incube a 80°C durante 15 min, a continuación, añada 200 µL de Buffer RLC. Para obtener ADN, resuspenda el sedimento conservado en 180 µL de Buffer ATL con 20 µL de Proteinase K; incube a 56°C durante 1 h, a continuación, a 90°C durante 2 h. Añada 200 µL de Buffer AL.Ejemplo: IVD5116. | Conserve ambas fracciones en la etapa de separación. El sobrenadante destinado a ARN y el sedimento destinado a ADN reciben tratamientos de digestión y térmicos diferentes. |
5. Células cultivadas
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN: recolección y resuspensión | Recoja <2 × 10⁶ células a 500 × g durante 5 min. Retire el medio. Resuspenda el sedimento en 250 µL de PBS con 20 µL de Proteinase K; añada 250 µL de Buffer AL, mezcle e incube a 70°C durante 10 min.Ejemplo: D3018. | Conserve el sedimento celular. Disperse los agregados celulares antes de la lisis. |
| ARN: células en suspensión | Recoja 3–5 × 10⁶ células a 500 × g durante 10 min. Retire el medio por completo, disgregue el sedimento y añada 500–600 µL de RTL Lysis Buffer. Agite bien en vórtex.Ejemplo: IVD3020. | Conserve el sedimento celular. Proceda de inmediato a la lisis para extraer ARN. Este ejemplo no especifica una digestión con calentamiento. |
| ARN: células adherentes | Retire el medio de cultivo. Para la preparación de 3–5 × 10⁶ células, añada 600 µL de RTL Lysis Buffer directamente a la placa y pipetee repetidamente para lisar y dispersar las células.Ejemplo: IVD3020. | La lisis directa evita una etapa independiente de recolección. Ajuste el volumen de tampón a la carga celular; un lisado muy viscoso puede requerir más tampón según las instrucciones del kit. |
6. Otras muestras clínicas
6.1 Orina
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN celular | Centrifugue hasta 1 mL de orina a 6,000 × g durante 2 min. Deseche el sobrenadante. Añada 500 µL de Buffer AE, agite en vórtex durante 5 s y repita la centrifugación. Retire el líquido; añada 200 µL de Buffer ATL y 20 µL de Proteinase K. Incube a 56°C durante 1 h con agitación a 900 rpm. Añada 200 µL de Buffer AL y mezcle.Ejemplo: D3125. | Conserve el sedimento celular. Si los espermatozoides son relevantes para el ADN que desea extraer, el manual permite añadir 10 µL de 1 M DTT durante la digestión. El ADN libre de células presente en la orina desechada queda fuera del objetivo de este método. |
| ARN celular | Centrifugue hasta 10 mL de orina a 1,600 × g durante 10 min. Retire el sobrenadante y añada 500–600 µL de RTL Lysis Buffer a las células recogidas. Agite bien en vórtex.Ejemplo: IVD3020. | Conserve el sedimento celular. Procese de inmediato en las condiciones seleccionadas para la manipulación de ARN. |
| ADN libre de células | Centrifugue la orina a 16,000 × g durante 10 min a RT. Transfiera con cuidado el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo sin alterar el sedimento. Utilice el sobrenadante como material de partida para la lisis y extracción de ADN libre de células.Ejemplo: IVD3182. | Conserve el sobrenadante; deseche el sedimento celular. |
6.2 Líquido amniótico
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN celular: recolección y digestión | Centrifugue el líquido amniótico a 2,000 × g durante 10 min; deseche el líquido. Resuspenda el sedimento celular en 200 µL de Buffer ATL y 20 µL de Proteinase K. Incube a 55°C durante 15–20 min con agitación a 800–1,000 rpm. Añada 200 µL de Buffer AL, mezcle bien e incorpore al flujo de extracción automatizada correspondiente.Ejemplo: IVD3101. | Conserve el sedimento celular. |
6.3 Saliva e hisopos
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN de saliva: uso directo de la muestra líquida | Combine 500 µL de saliva con 20 µL de Proteinase K y 500 µL de Buffer AL. Mezcle bien e incube a 65°C durante 30 min.Ejemplo: D3018. | Utilice la alícuota líquida. La saliva que contiene un reactivo de conservación requiere instrucciones de compatibilidad específicas para ese reactivo. |
| ADN de hisopos secos: digestión sobre el hisopo | Coloque el hisopo seco en un tubo de 2 mL. Añada 500 µL de Buffer ATL y 20 µL de Proteinase K. Incube con agitación a 55°C durante 15 min. Añada 500 µL de Buffer AL y mezcle.Ejemplo: D3018. | Mantenga el material que contiene la muestra en contacto con el digerido. Recupere el lisado liberado para las etapas de purificación del kit. |
| ADN bacteriano: liberación y sedimentación de bacterias | Añada 0.5–1 mL de solución salina o agua estéril al hisopo. Déjelo en remojo unos minutos, agite en vórtex durante 15–30 s y transfiera la suspensión. Recoja las bacterias a 10,000 × g durante 5 min. Resuspenda el sedimento en 400 µL de Buffer P1 y 20 µL de Lysozyme preparada según el kit; incube a RT durante 20 min. Añada 400 µL de Buffer DL y 20 µL de Proteinase K; incube a 70°C durante 10 min. Centrifugue a 10,000 × g durante 3 min.Ejemplo: D3146. | Conserve el sedimento bacteriano antes de la lisis y el sobrenadante después de la digestión. Los microorganismos difíciles pueden necesitar el tratamiento adicional de disgregación de la pared celular indicado en D3146. |
| ADN/ARN viral: líquido de remojo del hisopo | Utilice 200 µL de líquido de remojo del hisopo compatible con 20 µL de PK/Carrier RNA. Añada 400 µL de Buffer VLE, agite en vórtex durante 15 s e incube a RT durante 5–10 min.Ejemplo: IVD4175, aplicación para solución de remojo. | Utilice la alícuota líquida. Confirme la compatibilidad del medio de transporte del hisopo. |
6.4 Esputo
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ARN de patógenos: licuefacción, concentración y disgregación con microesferas | Añada 4–5 volúmenes de solución de DTT al 0.1% en agua libre de nucleasas a 1–2 mL de esputo. Mezcle e incube a RT durante 15–30 min, agitando repetidamente en vórtex o mediante agitación hasta que desaparezcan los agregados. Centrifugue a 2,500–4,000 × g durante 10 min. Retire el exceso de sobrenadante, dejando aproximadamente 500 µL de líquido con el sedimento, y resuspenda bien. Transfiera la suspensión al tubo con microesferas suministrado. Añada 50 µL de Buffer SDS y 20 µL de Proteinase K. Agite en vórtex a velocidad máxima durante 10 min, o aplique el tratamiento con homogeneizador de microesferas especificado durante 60–90 s. Incube a 55°C durante 10 min, a continuación, centrifugue brevemente para recoger las gotas. Utilice 250–300 µL de muestra preparada para la purificación.Ejemplo: IVD6672C. | Conserve la suspensión que contiene el sedimento después de la concentración. El DTT reduce la viscosidad del moco; la disgregación con microesferas libera los ácidos nucleicos de microorganismos difíciles de lisar. La concentración del 0.1% corresponde a la solución de DTT añadida. El tratamiento posterior con DNase I elimina el ADN para recuperar ARN. |
6.5 Lavado broncoalveolar y otros líquidos corporales
Los siguientes ejemplos distinguen la extracción directa de patógenos del enriquecimiento selectivo de ADN microbiano.
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| Líquido de lavado broncoalveolar: ADN/ARN de patógenos | Siga las instrucciones de licuefacción con DTT de R6672B para líquido de lavado; el manual no especifica la concentración de DTT ni la proporción de mezcla. Para material rico en células, la opción de clarificación es 500 × g durante 5 min, conservando el sobrenadante. Añada aproximadamente 500 µL de muestra preparada al tubo con microesferas junto con 50 µL de Buffer SDS (20%). Agite en vórtex a velocidad máxima durante 10 min, o utilice el molino de microesferas especificado durante 60–120 s. Centrifugue a 13,000 × g durante 5 min; tome 250 µL de sobrenadante para la preparación de purificación del kit.Ejemplo: R6672B, instrucciones para líquido de lavado y protocolo de disgregación directa. | Conserve el sobrenadante en las etapas de clarificación indicadas. La clarificación a baja velocidad puede excluir los objetivos asociados a células. En este kit, Proteinase K se añade junto con los reactivos de unión posteriores; no se especifica una predigestión independiente con calentamiento. |
| LCR o líquido ascítico: extracción directa de ADN | Añada 150 µL de Buffer TL y 20 µL de Proteinase K al tubo con microesferas suministrado y, a continuación, añada 300 µL de líquido cefalorraquídeo (LCR) o líquido ascítico. Agite en vórtex a velocidad máxima durante 10 min, o aplique el tratamiento con molino de microesferas especificado durante 60–90 s. Centrifugue a 13,000 × g durante 3 min y transfiera 250 µL de sobrenadante para la purificación.Ejemplo: D3148, protocolo 1. | Utilice inicialmente la alícuota líquida y conserve el lisado clarificado después de la disgregación. Esta vía de extracción directa de ADN no incluye la eliminación selectiva del material del hospedador. Por tanto, puede recuperarse ADN del hospedador junto con el ADN microbiano. |
| LCR o líquido ascítico: enriquecimiento de ADN microbiano | Centrifugue 1–1.8 mL de muestra a 13,000 × g durante 10 min. Deje 0.7 mL de líquido con el sedimento y resuspenda. Añada 1 mL de Buffer LBX1 y 5 µL de Proteinase K; incube a RT durante 10 min, mezclando periódicamente. Centrifugue a 13,000 × g durante 10 min; deje aproximadamente 50 µL de líquido con el sedimento y resuspenda. Añada 200 µL de DNase Buffer y 1 µL de DNase I preparada según el kit (10 mg/mL); incube a 37°C durante 15 min con agitación a 600–900 rpm. Añada 200 µL de Buffer TL y 15 µL de Proteinase K; transfiera al tubo con microesferas suministrado. Agite en vórtex a velocidad máxima durante 10 min, o utilice el molino de microesferas especificado durante 60–90 s. Centrifugue a 13,000 × g durante 3 min; transfiera 250 µL de sobrenadante para la purificación.Ejemplo: D3148, protocolo 2. | Conserve el sedimento microbiano durante el enriquecimiento y, después, el sobrenadante del lisado tras la disgregación microbiana. La lisis del hospedador y el tratamiento con DNasa preceden a la lisis microbiana. Así se selecciona una fracción de ADN diferente de la obtenida por la vía directa y puede perderse ADN extracelular o de microorganismos dañados. |
7. Tejidos vegetales
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN vegetal, método habitual: molienda y lisis | Muela el tejido en nitrógeno líquido o utilice una disgregación adecuada con microesferas. Para una prueba inicial, utilice 50 mg de tejido fresco/congelado; D3164 admite hasta 100 mg de tejido húmedo o 20 mg de tejido seco. Añada 600 µL de Buffer SPL y 10 µL de solución de RNase A del kit; disperse bien. Incube a 65°C durante 10 min, invirtiendo 2–3 veces. Añada 200 µL de Buffer PS, mezcle, incube en hielo durante 5 min y centrifugue a >13,000 × g durante 5 min. Transfiera hasta 600 µL de sobrenadante.Ejemplo: D3164. | Conserve el lisado clarificado. Evite los agregados de tejido. En la molienda con nitrógeno líquido, mantenga el polvo congelado hasta añadir el tampón. |
| ADN vegetal de muestras ricas en polifenoles: química específica | Muela en nitrógeno líquido. Comience con 50 mg de tejido fresco/congelado o 15 mg de tejido seco. Añada 700 µL de Buffer PAL, preparado con 2% PVP-40 (w/v) y 1% 2-mercaptoethanol (v/v) y precalentado a 65°C. Incube a 65°C durante 15–30 min, mezclando 2–3 veces.Ejemplo: D3187, protocolo B. | Continúe con la secuencia específica de extracción y clarificación basada en CTAB. |
| ARN, método habitual: molienda y lisis | Muela bien el tejido en nitrógeno líquido y mantenga el polvo congelado hasta añadir el tampón. Comience con ≤50 mg de tejido; la cantidad de muestra puede aumentarse a 150 mg tras la evaluación. Añada 750 µL de Buffer RLC o Buffer PRC1, preparado con 10 µL de 2-mercaptoethanol o 20 µL de DTT 2 M por cada 1 mL de tampón. Agite bien en vórtex y centrifugue a ≥12,000 × g durante 5 min.Ejemplo: R4151. | Conserve el sobrenadante clarificado para la columna de eliminación de ADN del kit. Utilice PRC1 si la muestra se solidifica durante la lisis con RLC. Una incubación breve a 56°C durante 3 min puede facilitar la lisis con PRC1, pero evite calentar muestras ricas en almidón, ya que el hinchamiento puede dificultar el procesamiento. |
| ARN para una amplia variedad de muestras: lisis con bajo contenido de guanidina | Muela el tejido en nitrógeno líquido. Comience con 100 mg de tejido habitual o rico en polifenoles, o 50 mg de tejido rico en mucílagos; no supere 150 mg. Añada inmediatamente 0.9 mL de Buffer RLF, preparado con 20 µL de solución madre de TCEP 1 M por cada 1 mL de RLF. Agite en vórtex durante 10–15 s y centrifugue a 14,000 × g durante 5 min a RT. Como alternativa, las hojas tiernas o los frutos pueden homogeneizarse directamente en 1 mL de RLF preparado; transfiera 0.8–0.9 mL de homogeneizado para la clarificación.Ejemplo: R4150. | Conserve el sobrenadante para la etapa de filtración de ADN genómico. Este sistema con bajo contenido de guanidina ofrece una opción de uso amplio para muestras poco conocidas y matrices vegetales complejas. Evite que el polvo congelado se descongele antes de añadir el reactivo. |
| ARN de muestras vegetales difíciles: lisis basada en CTAB y separación de fases | Muela el tejido en nitrógeno líquido y transfiera 50–100 mg de polvo a un tubo de 2 mL. Añada inmediatamente 700 µL de Buffer PAL, agite bien en vórtex e incube a 65°C durante 10 min. Cuando la muestra lo requiera, prepare PAL con 1% 2-mercaptoethanol (v/v); para material complejo rico en polifenoles, también puede añadirse 2% PVP-40 (w/v). Añada 700 µL de Buffer BDP o cloroformo, agite en vórtex durante 15 s y centrifugue a 13,000 × g durante 5 min a RT. Transfiera aproximadamente 500 µL de la fase acuosa superior.Ejemplo: R4165. | Conserve la fase acuosa superior sin alterar la interfase. Esta vía basada en CTAB está destinada a matrices vegetales difíciles. El manual permite omitir PVP-40 y 2-mercaptoethanol para la mayoría de las muestras. Para aplicaciones muy sensibles a la contaminación con ADN, utilice ≤50 mg de tejido; la purificación posterior incluye un tratamiento con DNase I. |
8. Muestras de bacterias, levaduras y hongos
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN bacteriano: pretratamiento de la pared celular | Centrifugue 0.5–2 mL de cultivo a 10,000 × g durante 5 min. Retire el medio. Resuspenda en 400 µL de Buffer P1 y 20 µL de Lysozyme preparada según el kit; incube a RT durante 20 min. Añada 400 µL de Buffer DL y 20 µL de Proteinase K; mezcle e incube a 70°C durante 10 min. Centrifugue a 10,000 × g durante 3 min.Ejemplo: D3146. | Conserve las bacterias antes de la lisis y el sobrenadante después de la digestión. Las células difíciles pueden requerir el tratamiento adicional con enzimas o microesferas del kit; la lisozima por sí sola no tiene la misma eficacia para todas las bacterias. |
| ARN bacteriano: pretratamiento enzimático | Recoja 0.5–1.8 mL de cultivo en fase exponencial (<1 × 10⁹ células) a 12,000 × g durante 1 min. Retire el medio. Añada 100 µL de Buffer TE y 10–20 µL de Lysozyme (50 mg/mL); resuspenda e incube a RT durante 5–15 min. Añada 500 µL de Buffer RLC preparado con 2-mercaptoethanol según las instrucciones del kit, agite en vórtex e incube a RT durante 5 min. Centrifugue a 12,000 × g durante 1 min.Ejemplo: R4181, método enzimático. | Conserve el sobrenadante para la etapa de filtración de ADN genómico. Esta vía enzimática abarca bacterias gramnegativas y algunas grampositivas. R4181 ofrece una vía independiente de molienda con microesferas para células difíciles. |
| ADN de levaduras: digestión de la pared celular | Recoja 1–1.5 mL de cultivo a 5,000 × g durante 5 min. Resuspenda en 300 µL de Buffer SE, 10 µL de 2-mercaptoethanol y 30 µL de Lyticase Mixture suministrada. Incube con agitación a 37°C durante 30–60 min. Centrifugue a 5,000 × g durante 5 min; deseche el sobrenadante. Resuspenda en 300 µL de Buffer ATL, añada 300 µL de Buffer DL y 10 µL de Proteinase K, a continuación, incube a 70°C durante 10 min. Centrifugue a 10,000 × g durante 3 min y transfiera 500 µL de sobrenadante.Ejemplo: D3147. | Conserve el sedimento de células tratadas antes de la lisis y el lisado clarificado después. Utilice la mezcla enzimática suministrada o iguale su actividad si emplea un sustituto. El kit incluye una disgregación adicional opcional con microesferas. |
| ARN fúngico: disgregación mecánica en el reactivo | Transfiera <10 mg de material fúngico al tubo con microesferas para hongos/bacterias especificado. Añada 1 mL de MagZol Reagent y agite en vórtex a alta velocidad durante 5–10 min. Para la separación de fases, añada 100 µL de Buffer BCP, agite enérgicamente a mano durante 15 s, deje reposar a RT durante 3 min y centrifugue a 12,000 × g durante 15 min a 4°C.Ejemplo: R6623. | Conserve la fase acuosa superior después de la separación. La disgregación se realiza en el reactivo para ARN; utilice el tubo con microesferas especificado. |
| ADN plasmídico: lisis alcalina controlada | Recoja 25–50 mL de cultivo a 3,000–5,000 × g durante 10 min a RT. Resuspenda por completo el sedimento en 2.5 mL de Buffer E1/RNase A. Añada 2.5 mL de Buffer E2, invierta suavemente 4–6 veces y limite la lisis alcalina a un máximo de 5 min. Añada 2.5 mL de Buffer E3 y mezcle inmediatamente por inversión. Centrifugue a 3,000–5,000 × g durante 5 min; pase el sobrenadante por el dispositivo de clarificación de lisados del kit.Ejemplo: P1231. | Conserve el líquido clarificado después de la neutralización. Evite agitar en vórtex después de añadir E2. |
9. Heces y suelo
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN de heces: disgregación con microesferas y eliminación de inhibidores | Transfiera 50–100 mg de heces al tubo con microesferas suministrado con 800 µL de Buffer SOL. Agite en vórtex a velocidad máxima durante 10 min, o utilice el tratamiento con FastPrep-24 especificado, 6.5 m/s, dos veces durante 45 s. Centrifugue brevemente; añada 60 µL de Buffer SDS e incube a 65°C durante 10 min. Centrifugue a 13,000 × g durante 1 min. Transfiera 600 µL de sobrenadante; mezcle con 150 µL de Buffer PS y 150 µL de Absorber Solution, deje reposar durante 3 min y centrifugue a ≥13,000 × g durante 5 min.Ejemplo: D3142, protocolo estándar. | Conserve el sobrenadante final clarificado. El adsorbente elimina inhibidores, pero también puede reducir la recuperación de ácidos nucleicos; el kit permite omitirlo para determinados lisados con bajo contenido de ácidos nucleicos o poco coloreados. |
| ADN de suelo: la misma vía de lisis estándar | Utilice 250–500 mg de suelo con 800 µL de Buffer SOL en el tubo con microesferas suministrado. Siga la disgregación con microesferas, el tratamiento de 60 µL de SDS / 65°C durante 10 min y la clarificación con PS/Absorber descritos en la fila anterior.Ejemplo: D3142, protocolo estándar. | Conserve el sobrenadante clarificado. Deje suficiente líquido y espacio en el tubo para el movimiento de las microesferas. El protocolo rápido de D3142 utiliza un orden diferente de adición de SDS; no combine las dos secuencias. |
| Coextracción de ADN/ARN ambiental | Utilice aproximadamente 0.5 g de suelo o 0.1–0.2 g de heces en el tubo con microesferas especificado. Añada 600 µL de Buffer STL y 100 µL de Buffer PCI. Agite en vórtex a velocidad máxima durante 10 min, o utilice el programa del molino de microesferas especificado durante 30–90 s. Centrifugue a 12,000 × g durante 5 min a RT. Transfiera aproximadamente 550 µL de sobrenadante, añada 200 µL de Buffer SL, agite en vórtex y centrifugue a 12,000 × g durante 5 min.Ejemplo: R5117B. | Conserve el sobrenadante final. |
10. Muestras de alimentos
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN de alimentos sólidos, método habitual | Transfiera 200 mg de una muestra representativa de alimento molido u homogeneizado a un tubo de 2 mL. Añada 800 µL de Buffer ATL y 10 µL de Proteinase K suministrada. Incube a 55°C durante 30 min con agitación a 1,500–2,000 rpm. Añada 5 µL de RNase Solution; incube a RT durante 10 min. Añada 400 µL de Buffer PPC, agite en vórtex durante 10–15 s y centrifugue a 13,000 × g durante 10 min.Ejemplo: D6350, protocolo simplificado para alimentos. | Conserve 500–800 µL de sobrenadante. Disperse por completo el material compactado; evite los sólidos flotantes y el sedimento durante la transferencia. |
| ADN de alimentos sólidos procesados | Muela hasta obtener un polvo fino. Utilice 100–200 mg, o ≤100 mg de material rico en almidón. Añada 900 µL de Buffer MTL y 20 µL de Proteinase K (20 mg/mL); agite en vórtex durante 30–60 s. Incube a 65°C durante 1–3 h, invirtiendo ocasionalmente. Añada 300 µL de Buffer PS, agite en vórtex durante 30 s y coloque en hielo durante 5 min. Centrifugue a 13,000 × g durante 5 min.Ejemplo: D3169, protocolo para alimentos sólidos. | Conserve 200–600 µL de sobrenadante para la siguiente etapa del kit. Una cantidad elevada de material rico en almidón puede dejar un volumen insuficiente de líquido recuperable. |
| Alimentos semisólidos: preparación basada en el sedimento | Centrifugue a 13,000 × g durante 5 min. Conserve un sedimento de ≤0.3 mL; lave con PBS o solución salina si la matriz lo requiere. Añada 900 µL de Buffer MTL y 20 µL de Proteinase K (20 mg/mL). Incube a 65°C durante 1–3 h. Añada 300 µL de Buffer PS, agite en vórtex durante 30 s, enfríe en hielo durante 5 min y centrifugue a 13,000 × g durante 5 min.Ejemplo: D3169, protocolo para alimentos semisólidos. | Conserve inicialmente el sedimento y, después, 200–600 µL de lisado clarificado. Esta vía selecciona los sólidos que contienen el objetivo. Las muestras que no producen sedimento requieren la preparación alternativa de D3169. |
| Aceite alimentario: recuperación de la fracción acuosa | Distribuya el aceite en cuatro tubos de 50 mL, con 40 mL de aceite por tubo. Añada 2 mL de Buffer ATL por tubo y agite enérgicamente. Añada 1 mL de Buffer PPB por tubo, mezcle e incube a RT durante 10 min, mezclando dos veces. Añada 3 mL de Buffer PPC por tubo, agite durante 1 min y centrifugue a 4,000 × g durante más de 20 min. Retire la fase oleosa superior y reúna las fases acuosas inferiores.Ejemplo: D6350, protocolo para aceites. | Conserve el líquido acuoso inferior. Evite el aceite y la interfase blanca. |
11. Materiales de muestras forenses
El soporte que contiene la muestra, el grado de degradación y el objetivo de extracción determinan la preparación. Las manchas de sangre, las manchas de semen, el pelo, las uñas, los huesos y los dientes no requieren todos la misma química de digestión.
| Objetivo / método | Ejemplo representativo de preparación e inicio de la lisis | Fracción y punto clave |
|---|---|---|
| ADN de manchas de sangre: pequeños discos perforados | Coloque de uno a tres fragmentos de 3 mm que contengan la muestra en un tubo de 2 mL. Añada 200 µL de Buffer ATL y 20 µL de Proteinase K. Incube a 55°C durante 60 min con agitación a 900–1,200 rpm. Añada 200 µL de Buffer AL; incube a 70°C durante 10 min con la misma agitación. Centrifugue a 13,000 × g durante 1 min.Ejemplo: D3125, protocolo para manchas de sangre. | Conserve el sobrenadante y deje atrás el soporte sólido. La cantidad de muestra se refiere a los fragmentos manchados, no a una cantidad ilimitada del material de soporte. |
| ADN de manchas de semen: digestión asistida por un agente reductor | Coloque el material que contiene la muestra en un tubo de 2 mL. Añada 400 µL de Buffer ATL, 4 µL de 1 M DTT y 40 µL de Proteinase K. Incube a 55°C durante 3–24 h con agitación a 1,000–1,500 rpm. Centrifugue a 13,000 × g durante 3 min y transfiera 250–300 µL de sobrenadante.Ejemplo: D6359D, protocolo forense en un solo tubo. | Conserve el sobrenadante del digerido. El DTT facilita la lisis de las estructuras espermáticas ricas en enlaces disulfuro. Esta es una preparación de ADN total, no una extracción diferencial que separa el ADN espermático del no espermático. |
| ADN de pelo y uñas: digestión asistida por un agente reductor | Transfiera el material de pelo o uñas a un tubo de 2 mL. Añada 400 µL de Buffer ATL, 4 µL de 1 M DTT y 40 µL de Proteinase K. Incube a 55°C durante 3–24 h con agitación a 1,000–1,500 rpm. Centrifugue a 13,000 × g durante 3 min y transfiera 250–300 µL de sobrenadante.Ejemplo: D6359D, protocolo forense en un solo tubo. | Conserve el sobrenadante. El DTT favorece la digestión del material rico en queratina. |
| ADN de huesos y dientes: digestión del polvo | Prepare un polvo fino mediante el método de molienda especificado. Transfiera 100–150 mg de polvo; añada 400 µL de Buffer BGL, 4 µL de 1 M DTT y 40 µL de Proteinase K. Incube a 55°C durante 3–24 h con agitación a 1,000–1,500 rpm. Centrifugue a 13,000 × g durante 3 min y transfiera 250–300 µL de sobrenadante.Ejemplo: D6359D, protocolo para huesos/dientes en un solo tubo. | Conserve el sobrenadante del digerido. El polvo fino mejora el contacto con los reactivos. |
| ARN de huesos o dientes: molienda en congelación | Muela en nitrógeno líquido. Transfiera 100–200 mg de polvo y añada inmediatamente 1 mL de MagZol Reagent; disperse bien. Añada 100 µL de Buffer BCP, agite a mano durante 15 s y deje reposar a RT durante 3 min. Centrifugue a 12,000 × g durante 15 min a 4°C.Ejemplo: R6623. | Conserve la fase acuosa superior. Añada el reactivo de lisis para ARN inmediatamente después de la molienda en congelación. |
Adaptación de una muestra no incluida: Considere la matriz, la ubicación del objetivo y los requisitos de lisis y, a continuación, verifique la recuperación y el rendimiento en el ensayo previsto. Los nombres de los reactivos y las proporciones numéricas son específicos de cada protocolo. Los códigos de ejemplo identifican el método de origen. La preparación de líquido amniótico de IVD3101 es un suplemento proporcionado, no un procedimiento incluido en su manual.