DNase Set

La desoxirribonucleasa pancreática bovina, también conocida como DNasa, es una endonucleasa que hidroliza los enlaces fosfodiéster del ADN, especialmente los adyacentes a nucleótidos de pirimidina, y genera polinucleótidos con extremos 3′-hidroxilo y 5′-fosfato libres. Su pH óptimo es aproximadamente 7,8. La DNasa puede ser activada por iones metálicos divalentes e inhibida por agentes quelantes como el EDTA y por el dodecilsulfato de sodio (SDS). Los iones de calcio a una concentración de 5 mM pueden actuar como estabilizadores y proteger la DNasa frente a la degradación por otras hidrolasas. Este producto se obtiene a partir de páncreas bovino y se purifica mediante cromatografía para reducir la contaminación por otras enzimas hidrolíticas.

El RNase Free DNase I Set está especialmente diseñado para kits de extracción de ARN mediante columnas o perlas magnéticas. Tras la lisis de las muestras biológicas, se añade etanol para ajustar las condiciones de unión y el lisado se transfiere a una columna o a perlas magnéticas para adsorber el ARN. Después del lavado, se añaden DNasa I y DNase Buffer a la membrana de la columna o a las perlas magnéticas, y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente (25–37 °C) para eliminar el ADN adsorbido. A continuación, la DNasa y los fragmentos de ADN degradado se eliminan mediante lavado y, finalmente, el ARN se eluye con agua tratada con DEPC.

Para conocer sistemas que incorporan el tratamiento con DNasa en columna o sobre perlas magnéticas, consulte los sistemas Magen de extracción de ARN y los recursos sobre flujos de trabajo diseñados para purificar ARN con un contenido reducido de ADN.

Especificaciones

Ventajas

• Proteína natural purificada procedente de páncreas bovino
• Alta actividad y pureza, >10 unidades Kunitz/µL
• Excelente relación calidad-precio
• Sin contaminación detectable por RNasa
• Formato líquido listo para usar
• Admite volúmenes de uso elevados (10 µL o 100 µL por reacción) para eliminar una mayor cantidad de ADN genómico

Validación técnica

El DNase I Set se validó para comprobar la ausencia de actividad RNasa utilizando muestras de ARN bacteriano. Tras el tratamiento con DNasa I, la electroforesis en gel de agarosa mostró bandas de ARN intactas y sin degradación visible, lo que indica que no se detectó contaminación por RNasa en las condiciones evaluadas.

La actividad de la DNasa se evaluó utilizando muestras obtenidas durante la extracción de ADN de tejido hepático. En comparación con los grupos sin DNasa y con Buffer DNase, las muestras tratadas con DNasa I mostraron una marcada reducción del rendimiento de ADN medido mediante NanoDrop y no presentaron bandas evidentes de ADN genómico en la electroforesis en gel de agarosa, lo que respalda una actividad eficaz de digestión del ADN.

El efecto de la digestión con DNasa I sobre la detección posterior mediante qPCR se evaluó adicionalmente utilizando muestras de sangre porcina enriquecidas con ADN del VHB. Las muestras de control sin tratamiento con DNasa presentaron valores de Ct cercanos a 30, mientras que en las muestras tratadas con DNasa no se detectó señal de Ct. Estos resultados indican que los moldes de ADN se degradaron eficazmente y que no quedó ADN amplificable detectable en las condiciones evaluadas.

Los ensayos de estabilidad mostraron que la DNasa I líquida conservada a temperatura ambiente durante dos semanas presentó un rendimiento similar al de la DNasa I conservada a 4 °C en las pruebas con ARN bacteriano y de digestión de ADN de tejidos. Estos resultados respaldan el uso del DNase I Set en flujos de trabajo de extracción de ARN mediante columnas o perlas magnéticas que requieren una eliminación fiable del ADN genómico.

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Storage and Stability