Introducción
Magen fabrica sistemas de extracción de ácidos nucleicos desde hace más de diez años, con un enfoque constante en las tecnologías de purificación mediante membranas de sílice. El HiPure FFPE DNA Kit representa la configuración en columna dentro de la gama Magen para FFPE y está diseñado para recuperar ADN genómico a partir de secciones de tejido incluido en parafina.
El flujo combina una química de digestión optimizada con adsorción en membrana de sílice para liberar ADN fragmentado de tejidos fijados con formalina y reducir el arrastre de inhibidores durante la purificación. La estructura de la membrana y la composición del tampón de unión se han perfeccionado mediante ciclos internos de optimización para favorecer una recuperación uniforme de ADN a partir de muestras tumorales archivadas.
Las pruebas comparativas internas con tejidos FFPE mostraron un rendimiento estable de amplificación de ADN mediante qPCR bajo condiciones definidas de extracción, comparable al de sistemas en columna ampliamente utilizados para la purificación de FFPE.
Los laboratorios que trabajan con distintos formatos de flujo pueden consultar:
HiPure FFPE DNA Kit funciona como el modelo de referencia en columna dentro del sistema Magen de extracción de FFPE.
Detalles
Flujo de trabajo
Descripción general del flujo de trabajo
El flujo HiPure FFPE DNA utiliza una ruta basada en columnas de sílice para purificar ADN genómico a partir de secciones FFPE. Tras la desparafinización, la digestión con Proteinase K y la reversión de los entrecruzamientos asistida por calor, se establecen las condiciones de unión del ADN y el ADN liberado se captura en la membrana de sílice. A continuación, el flujo continúa con lavado, secado y elución para recuperar ADN de FFPE purificado destinado a análisis moleculares posteriores.
Lógica de procesamiento de la muestra
Este flujo está diseñado en torno a los principales desafíos de la recuperación de ADN de FFPE: eliminación de la parafina, digestión completa y reversión de las modificaciones relacionadas con la fijación. La mayor variación dependiente de la muestra se concentra en la etapa de digestión, donde el tipo de tejido, el grosor de la sección y el estado del bloque pueden influir en el tiempo de procesamiento. Una vez establecidas las condiciones de unión del ADN, las etapas posteriores de purificación en columna se mantienen uniformes.
Características de tiempo y flujo de trabajo
En operación manual habitual, el flujo completo suele requerir aproximadamente 2,5–14 horas, principalmente según los requisitos de digestión del tejido FFPE. Para consultar la lógica detallada de manipulación paso a paso, la orientación del flujo y los tiempos estimados de procesamiento, consulte la Nota de flujo de trabajo en la sección de descargas.
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Funciones principales
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Aislamiento de ADN total a partir de muestras de tejido FFPE
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Aplicaciones
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PCR, Southern blot y detección de ADN viral, entre otras aplicaciones
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Método de purificación
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Minicolumna de centrifugación
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Tecnología de purificación
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Tecnología de sílice
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Método de procesamiento
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Manual (centrifugación o vacío)
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Tipo de muestra
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Tejido y secciones fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE)
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Cantidad de muestra
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<20mg
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Volumen de elución
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>15µl
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Tiempo por ejecución
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2,5–14 horas, según los requisitos de digestión del tejido FFPE
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Volumen líquido admitido por columna
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4ml
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Capacidad de unión de la columna
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100μg
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Características de ingeniería
Digestión para la reversión de entrecruzamientos
El flujo de lisis facilita la reversión controlada de los entrecruzamientos inducidos por formaldehído que suelen estar presentes en los tejidos FFPE, mejorando la accesibilidad del ADN genómico durante la extracción.
Adsorción de ADN en membrana de sílice
Una membrana de sílice multicapa permite adsorber el ADN fragmentado característico de las muestras FFPE y, al mismo tiempo, mantener un comportamiento de filtración predecible.
Eliminación de inhibidores
Los tampones de lavado optimizados reducen los componentes residuales de parafina, los fragmentos proteicos y los inhibidores de PCR durante la purificación.
Rendimiento reproducible de la columna
La fabricación de la membrana y la formulación de los tampones se controlan mediante procedimientos internos de control de calidad para mantener una recuperación estable de ADN entre lotes de producción.
Validación técnica
Amplificación de ADN
El ADN extraído de secciones de tejido FFPE permitió la amplificación mediante qPCR en múltiples diluciones de molde, lo que confirma su idoneidad para flujos sensibles de detección molecular.
Evaluación comparativa de la extracción
Los experimentos internos que compararon distintos flujos de purificación de FFPE mostraron una recuperación de ADN y un comportamiento de amplificación uniformes frente a sistemas establecidos de extracción en columna.
Compatibilidad con flujos posteriores
El ADN purificado fue compatible con flujos de preparación para secuenciación y análisis de mutaciones utilizados habitualmente en laboratorios de investigación oncológica.
Estabilidad entre lotes
El rendimiento de extracción se mantuvo estable entre los lotes de producción validados durante las pruebas internas de verificación.
Resumen de escenarios de aplicación
Los flujos de extracción de ADN de FFPE se seleccionan según el ensayo posterior. En aplicaciones específicas basadas en PCR, como MSI-PCR, secuenciación Sanger o análisis de mutaciones concretas, el requisito principal es obtener ADN amplificable a partir de secciones FFPE. En aplicaciones orientadas a secuenciación, como WES, NGS dirigido, perfilado de metilación, análisis relacionados con HRD, evaluación de TMB o estudios con referencia tisular emparejada, pueden cobrar mayor importancia el manejo de fragmentos, el fondo de inhibidores y la compatibilidad con la preparación de bibliotecas.
Los ejemplos seleccionados a continuación resumen flujos de investigación publicados que utilizaron formatos Magen para la extracción de ADN de FFPE, entre ellos D3126 / HiPure FFPE DNA Kit, D6323B / MagPure FFPE DNA Kit y D6323D / MagPure FFPE DNA Kit High Pure. Los ejemplos se organizan para ilustrar contextos habituales de aplicación del ADN de FFPE, no para comparar directamente el rendimiento de los kits.
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Escenario de aplicación
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Formato relacionado
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Muestra/fuente de ADN
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Uso posterior en investigación
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Análisis de mutaciones del promotor de TERT en meningiomas de alto grado de novo para investigar el riesgo de progresión después de la radioterapia
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D3126
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Tejido tumoral FFPE de pacientes con meningioma de alto grado de novo, grados 2–3 de la OMS, tratados con radioterapia posoperatoria
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Extracción de ADN genómico para amplificación por PCR y secuenciación Sanger de mutaciones del promotor de TERT, como apoyo al análisis de la progresión tumoral, la supervivencia libre de progresión y los resultados de la radioterapia posoperatoria
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Comparación de paneles MSI-PCR en cáncer colorrectal y gástrico para optimizar las pruebas de patología molecular
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D3126
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Muestras FFPE de biopsia y cirugía de pacientes con cáncer colorrectal y gástrico
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Extracción de ADN genómico para detectar el estado MSI mediante PCR utilizando paneles NCI, de cinco mononucleótidos y de seis mononucleótidos, como apoyo a la comparación del rendimiento de los paneles, la interpretación de MSI-L y la selección del flujo MSI-PCR óptimo
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Evaluación de la malignidad de nódulos pulmonares mediante perfilado de metilación emparejado en tejido FFPE y plasma
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D6323B
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Muestras de tejido pulmonar FFPE malignas y benignas de pacientes con nódulos pulmonares detectados mediante TC
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Extracción de ADN genómico tisular para secuenciación de metilación del ADN, análisis de concordancia de metilación tejido-plasma y validación de un modelo integrado basado en sangre para diferenciar nódulos pulmonares malignos de lesiones benignas
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Ver más escenarios de aplicación
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Escenario de aplicación
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Formato relacionado
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Muestra/fuente de ADN
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Uso posterior en investigación
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Subtipado molecular del adenocarcinoma pancreático basado en CNV para investigar el pronóstico y la estratificación del tratamiento
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D6323B
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Muestras tumorales FFPE de pacientes con adenocarcinoma pancreático diagnosticado anatomopatológicamente en una cohorte china de 608 pacientes
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Extracción de ADN genómico tumoral para secuenciación dirigida de 566/764 genes, perfilado de mutaciones somáticas, análisis de variantes germinales en HRR, subtipado molecular basado en CNV y construcción de modelos de riesgo de recaída
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Monitorización posoperatoria de enfermedad residual mínima en CPNM mediante análisis personalizado de ctDNA informado por el tumor
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D6323D
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Secciones de tejido tumoral FFPE de pacientes con CPNM en estadio temprano, emparejadas con ADN normal de sangre periférica o capa leucocitaria
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Extracción de ADN genómico tumoral y ADN genómico normal emparejado para WES, diseño de paneles PROPHET específicos del paciente, monitorización posoperatoria de enfermedad residual mínima mediante ctDNA plasmático, predicción del riesgo de recurrencia y clasificación pronóstica TNMB
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Evaluación de HRD en tumores FFPE mediante cicatrices genómicas y análisis de CNV específico de alelo
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D6323B
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Muestras de tejido humano FFPE de cohortes de cáncer de ovario y de mama
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Extracción de ADN tumoral para secuenciación de paneles HRD basada en captura, análisis de CNV específico de alelo, modelización de la puntuación de cicatriz genómica y predicción de la respuesta a inhibidores de PARP
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Perfilado de mutaciones en HRR en cáncer de mama triple negativo temprano para investigar su asociación con la infiltración inmunitaria y el pronóstico
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D6323B
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Bloques tumorales FFPE archivados de pacientes con cáncer de mama triple negativo en estadio temprano
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Extracción de ADN genómico tumoral para NGS dirigido a HRR, análisis del espectro mutacional, estudio de asociación entre linfocitos T CD8+ y PD-L1, y estratificación pronóstica inmunogenómica combinada
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Investigación transancestral del panorama mutacional del hepatoblastoma pediátrico mediante WES emparejado de tumor FFPE y tejido no canceroso
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D6323B
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Muestras tumorales FFPE de hepatoblastoma y tejidos hepáticos no cancerosos correspondientes de pacientes pediátricos
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Extracción de ADN tumoral y de tejido no canceroso emparejado para WES, detección de mutaciones somáticas, análisis de alteraciones del número de copias, enriquecimiento de vías y comparación genómica transancestral
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Secuenciación tumoral FFPE emparejada para distinguir la interferencia de la hematopoyesis clonal en biopsia líquida
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D6323B
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Muestras de tejido tumoral FFPE de pacientes chinos con distintos tipos de cáncer, con ADN de linfocitos de sangre periférica y cfDNA plasmático emparejados
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Extracción de ADN genómico tumoral para secuenciación dirigida, validación de mutaciones candidatas de hematopoyesis clonal, exclusión de variantes derivadas del tumor y mejora de la interpretación de los resultados de biopsia líquida basados en cfDNA
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Perfilado de la carga mutacional tumoral y del fenotipo inmunitario en adenocarcinoma pulmonar para investigar la respuesta a la inmunoterapia en tumores con mutación en EGFR
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D6323B
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Bloques de tejido FFPE de adenocarcinoma pulmonar de pacientes quirúrgicos sin tratamiento previo
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Extracción de ADN tumoral para secuenciación con panel dirigido, evaluación de TMB, comparación de mutaciones en EGFR/KRAS/BRCA2 y análisis de asociación con fenotipos inmunitarios basados en PD-L1/CD8
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Nota: los ejemplos seleccionados se proporcionan para ilustrar la adecuación de los flujos de ADN de FFPE a distintas aplicaciones, entre ellas patología molecular basada en PCR, secuenciación Sanger, secuenciación dirigida, WES, perfilado de metilación, análisis relacionados con HRD y estudios con referencia tisular. No constituyen una lista completa de publicaciones ni una evaluación comparativa directa del rendimiento de los kits. La selección del producto debe considerar si el ensayo posterior requiere principalmente ADN amplificable para uso rutinario, ADN compatible con secuenciación o ADN de alta pureza para aplicaciones sensibles a inhibidores.
Kit Contents
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Contents
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D312602
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D312603
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Purification Times
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50 Preps
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250 Preps
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HiPure DNA Mini Columns I
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50
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250
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2ml Collection Tubes
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50
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250
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Buffer DPS
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30 ml
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150 ml
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Buffer ATL
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15 ml
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60 ml
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Buffer AL
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15 ml
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60 ml
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Buffer GW1*
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22 ml
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88 ml
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Buffer GW2*
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12 ml
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50 ml
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Proteinase K
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24 mg
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120 mg
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Protease Dissolve Buffer
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1.8 ml
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10 ml
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Buffer AE
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10 ml
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30 ml
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Storage and Stability
Proteinase K should be stored at 2-8°C upon arrival. However, short-term storage (up to 12 weeks) at room temperature (15-25°C) does not affect their performance. The remaining kit components can be stored at room temperature (15-25°C) and are stable for at least 18 months under these conditions. The entire kit can be stored at 2-8°C, but in this case buffers should be redissolved before use. Make sure that all buffers are at room temperature when used.
Experiment Data
