Detalles
Flujo de trabajo
Descripción general del flujo de trabajo
El HiPure Total RNA Plus Kit utiliza un flujo de trabajo con dos columnas de sílice para purificar ARN a partir de células cultivadas, tejidos animales y muestras vegetales. Tras la disgregación y la lisis química, el lisado se hace pasar primero por una columna de eliminación de ADN genómico para reducir este contaminante antes de establecer las condiciones de unión del ARN. A continuación, se añade etanol al filtrado que contiene el ARN y se carga en la columna de ARN, donde este queda retenido y se somete a lavado, secado y elución en agua libre de RNasas.
Lógica de procesamiento de las muestras
Este flujo de trabajo está diseñado para la extracción rutinaria de ARN de tejidos y células cuando resultan importantes la sencillez operativa y la eliminación previa de ADN genómico. Las principales variaciones en función de la muestra se producen durante la disgregación y la lisis, especialmente con tejidos y material vegetal. Una vez clarificado el lisado y pasado por la columna de eliminación de ADN, las etapas posteriores de unión, lavado y elución del ARN siguen un procedimiento uniforme en columna.
Duración y características del flujo de trabajo
En condiciones habituales de procesamiento manual, el flujo de trabajo suele completarse en aproximadamente 25–45 minutos, dependiendo principalmente de la disgregación de la muestra y la viscosidad del lisado. Esta ruta es adecuada para laboratorios que requieren un procedimiento sencillo de purificación de ARN mediante dos columnas, con reducción previa del ADN genómico. Para consultar las condiciones detalladas de cada etapa, las indicaciones del flujo de trabajo y los tiempos de procesamiento estimados, consulte la Nota del flujo de trabajo disponible en la sección de Descargas.
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Función principal
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Aislamiento de ARN total a partir de 20 mg de tejido, 150 mg de material vegetal o 5 × 106 células mediante dos columnas (incluida una columna de eliminación de ADN genómico)
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Aplicaciones
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RT-PCR, qRT-PCR, hibridación Northern y secuenciación de nueva generación
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Método de purificación
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Minicolumna de centrifugación
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Tecnología de purificación
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Tecnología de sílice y filtración de ADN
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Método de procesamiento
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Manual (centrifugación o vacío)
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Tipo de muestra
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Tejidos animales blandos, células cultivadas, linfocitos y tejidos vegetales simples
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Cantidad de muestra
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Células: ≤1 × 107
Tejido animal: 1–20 mg
Tejido vegetal: 50–150 mg
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Rendimiento
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2–100 µg
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Volumen de elución
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≥50 µl
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Duración por procesamiento
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Aproximadamente 25–45 minutos (según el tipo de muestra)
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Volumen máximo de carga por columna
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800 µl
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Capacidad de unión de la columna
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100 µg
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Características técnicas
Eliminación integrada de ADN genómico
El flujo de trabajo incluye una columna específica de eliminación de ADN genómico que reduce su contaminación antes de la purificación del ARN, disminuyendo la necesidad de realizar un tratamiento adicional con DNasa.
Química eficiente de unión del ARN
La adsorción en membrana de sílice permite la unión selectiva de las moléculas de ARN, mientras que las proteínas celulares y otros contaminantes se eliminan durante las etapas de lavado.
Lisis y eliminación de inhibidores optimizadas
Los tampones de extracción disgregan eficazmente las estructuras celulares y eliminan contaminantes que podrían interferir con las reacciones posteriores de transcripción inversa.
Flujo de trabajo en columna de centrifugación
El procedimiento de purificación es compatible con las centrífugas habituales de laboratorio y permite realizar flujos de trabajo rápidos de purificación de ARN en laboratorios de investigación.
Validación técnica
El HiPure Total RNA Plus Kit se evaluó como un flujo de trabajo rápido de extracción de ARN total basado en columnas de sílice y con eliminación integrada de ADN genómico. El kit utiliza una DNA Mini Column antes de la unión del ARN, lo que permite purificar ARN total a partir de células cultivadas y tejidos animales sin extracción con fenol/cloroform ni precipitación con isopropanol. El ARN purificado está destinado a aplicaciones posteriores como RT-PCR, hibridación Northern, purificación de ARN poli(A)+, ensayos de protección frente a nucleasas y traducción in vitro.
En las pruebas con tejidos ricos en proteínas y lípidos, se extrajo ARN de muestras de 10 mg de hígado de pollo y 10 mg de cerebro de pollo. Con 10 mg de hígado de pollo, el kit produjo rendimientos de ARN de 45,46–48,24 µg, con valores A260/280 de 2,11–2,12 y valores A260/230 de 1,75–2,23. Con 10 mg de cerebro de pollo, los rendimientos fueron de 4,29–4,55 µg, con valores A260/280 de 2,13–2,18 y valores A260/230 de 1,90–2,15 en las condiciones evaluadas.
Se realizó una comparación con un flujo de trabajo de referencia para la extracción de ARN en columna utilizando 5 mg, 10 mg, 20 mg y 40 mg de hígado de pollo. Con una entrada de 40 mg, R4111 produjo 147–156 µg de ARN, frente a 147 µg con el flujo de referencia. Con 20 mg, R4111 produjo 95–98 µg de ARN, frente a 84 µg con el flujo de referencia. Con 10 mg, R4111 produjo 41–47 µg de ARN, frente a 37 µg con el flujo de referencia, mientras que una entrada de 5 mg produjo 19–21 µg de ARN en las condiciones evaluadas.
En todo el intervalo de cantidades de hígado de pollo evaluado, R4111 mantuvo valores A260/280 de aproximadamente 2,11–2,15 y valores A260/230 de aproximadamente 2,07–2,28. La electroforesis en gel de agarosa mostró patrones de bandas de ARN intacto y ausencia de contaminación evidente por ADN genómico, lo que respalda la eficacia de la columna de eliminación de ADN genómico para reducir de forma rutinaria el ADN antes de la purificación del ARN.
El kit también se evaluó en un flujo de trabajo rápido de extracción a partir de células cultivadas, utilizando 5 × 106 células por muestra. Se procesaron seis muestras celulares en aproximadamente 30 minutos y el análisis electroforético mostró bandas claras de ARN total con buena integridad. Estos resultados respaldan el uso de R4111 como flujo de trabajo rápido de extracción de ARN total para muestras rutinarias de tejidos animales y células cultivadas cuando se requiere reducir el fondo de ADN genómico y acortar el tiempo de manipulación.
Resumen de escenarios de aplicación
R4111 es un flujo de trabajo de ARN total con dos columnas, diseñado para reducir el fondo de ADN genómico antes de la purificación del ARN. Al incorporar una etapa inicial de eliminación de ADN genómico, resulta adecuado para RNA-seq, RT-qPCR, análisis de ARN en células infectadas, cuantificación de ARN viral y estudios transcriptómicos en los que el arrastre de ADN podría afectar a la interpretación de los datos. Las aplicaciones seleccionadas a continuación incluyen estudios de infectividad viral, cribado de factores de restricción antiviral, diferenciación de células madre, análisis de elementos retrovirales endógenos e investigación transcripcional relacionada con el cáncer.
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Escenario de aplicación
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Origen de la muestra
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Uso posterior en investigación
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Investigación de la estructura del ARN genómico del virus del Zika y de su infectividad en células infectadas
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Células Huh7, U87MG y Vero infectadas por ZIKV, así como muestras de sobrenadante que contienen virus
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Extracción de ARN total para cuantificar el ARN de ZIKV mediante qRT-PCR, como apoyo al análisis de la estructura del ARN genómico viral, la infectividad de los linajes asiático y africano de ZIKV y las interacciones funcionales ARN–ARN de largo alcance.
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Cribado de variantes de la proteína Spike del SARS-CoV-2 mediante exposición en la superficie de células de mamífero
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Células HEK293T portadoras de bibliotecas lentivirales de variantes de Spike tras la selección por unión a ACE2 y por anticuerpos monoclonales
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Recuperación de ARN de poblaciones celulares clasificadas, seguida de transcripción inversa y secuenciación PacBio SMRT, para identificar a gran escala variantes de Spike con cambios en la afinidad por ACE2, el comportamiento relacionado con la infectividad y la evasión de anticuerpos monoclonales.
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Ver más escenarios de aplicación
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Escenario de aplicación
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Origen de la muestra
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Uso posterior en investigación
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Investigación de la especificación de linaje y del mecanismo regulador de SOX2 en células madre pluripotentes humanas
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Células madre pluripotentes humanas de tipo silvestre, con inactivación de PCGF6 o con inactivación de elementos reguladores de SOX2 durante la diferenciación neuroectodérmica
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Análisis mediante RNA-seq y qRT-PCR de la expresión de marcadores de linaje y genes reguladores, como apoyo al estudio de la activación de SOX2 mediada por PCGF6/MYC, la supresión de la señalización WNT y el equilibrio entre los destinos neuroectodérmico y mesendodérmico.
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Regulación de elementos retrovirales endógenos en células madre pluripotentes humanas
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Células madre embrionarias humanas, células HUES8/H9 y células madre pluripotentes expandidas cultivadas sin células alimentadoras, utilizadas en estudios reguladores de LTR/HERVK
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Extracción de ARN total para el análisis mediante RNA-seq de Illumina y RT-qPCR de transcritos LTR5 Hs/LTR5/HERVK y de la expresión génica del hospedador, como apoyo al estudio de elementos retrovirales endógenos activos con funciones reguladoras similares a potenciadores o promotores en células madre pluripotentes.
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Investigación de la disfunción mitocondrial, la autorrenovación y la diferenciación de linaje en células madre pluripotentes humanas
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Células madre pluripotentes humanas con reducción inducible de TFAM, cuerpos embrioides y muestras de diferenciación dirigida hacia ectodermo, mesodermo y endodermo
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Análisis mediante RNA-seq y qRT-PCR de la expresión génica mitocondrial, los genes del ciclo celular y marcadores de linaje como SOX1, PAX6, FOXA2, GATA4, SOX17, OCT4 y NANOG, como apoyo al estudio de cómo la disfunción mitocondrial dependiente de TFAM altera la proliferación, la autorrenovación y la diferenciación multilinaje de las células madre pluripotentes humanas.
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Investigación de la respuesta farmacológica del cáncer hepático y de los mecanismos de señalización relacionados con la N-miristoilación
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Líneas celulares de carcinoma hepatocelular, células Huh7/HepG2 tratadas con desloratadina y sistemas experimentales de carcinoma hepatocelular derivados de xenoinjertos y de pacientes
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Extracción de ARN total para analizar mediante qRT-PCR y RNA-seq los cambios transcripcionales inducidos por fármacos, la regulación de la vía NFκB/Bcl-2 y los mecanismos de progresión del cáncer hepático relacionados con NMT1/VILIP3.
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Investigación del microambiente tumoral del cáncer colorrectal y de la inmunidad antitumoral asociada a una variante de IgG1
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Tejidos tumorales de cáncer colorrectal humano, modelos murinos de carcinoma de colon y poblaciones de células inmunitarias del microambiente tumoral
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Análisis transcriptómico y de la respuesta inmunitaria mediante qPCR para estudiar cómo la variante hIgG1-G396R, específica de poblaciones asiáticas, configura el microambiente tumoral, incluidos la diferenciación de células plasmáticas, la activación de linfocitos T CD8+, el reclutamiento de células dendríticas y la formación de estructuras linfoides terciarias.
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Kit Contents
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Contents
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R411102
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D411103
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Purification Times
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50 Preps
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250 Preps
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HiPure DNA Mini Columns
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50
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250
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HiPure RNA Mini Columns
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50
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250
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2ml Collection Tubes
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100
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2 x 250
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Buffer RLC
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50 ml
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200 ml
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Buffer RW1
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50 ml
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200 ml
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Buffer RW2*
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12 ml
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2 x 50 ml
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RNase Free Water
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10 ml
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30 ml
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Storage and Stability
HiPureKit can be stored dry at room temperature (15-25°C) and are stable for at least18 months under these conditions. During shipment, crystals or precipitationmay form in the Buffer RLC. Dissolve by warming buffer to 37°C.
