Introducción
Magen desarrolla tecnologías de extracción de ácidos nucleicos desde hace más de diez años, con un enfoque constante en los sistemas de purificación basados en membrana. HiPure Circulating DNA Kit (IVD3182) representa el formato en columna dentro de la gama de ADN circulante y está diseñado para flujos con plasma y suero de 1–5 ml de volumen de entrada.
El kit utiliza un sistema de purificación con membrana de sílice asistido por vacío, optimizado para recuperar fragmentos de ADN circulante de baja abundancia y mantener al mismo tiempo un rendimiento estable de filtración. La arquitectura de la membrana y la formulación del tampón de unión se han perfeccionado mediante procesos internos de optimización y validación.
En las pruebas internas de verificación, la eficiencia de recuperación de fragmentos cortos de ADN superó habitualmente el 80% bajo condiciones controladas de extracción. Los experimentos con entradas de 5 ml de plasma mostraron concentraciones estables de cfDNA entre réplicas y un rendimiento comparable al de sistemas consolidados de purificación de ADN circulante en columna procesados bajo condiciones equivalentes.
· Los laboratorios que trabajan con distintos formatos de flujo pueden consultar:
· Volúmenes pequeños de plasma, 0,6 ml → ( D3180 )
· Procesamiento de 1 ml → ( D3181 )
· Flujo basado en centrifugación → ( D3182D )
· Automatización con perlas magnéticas → ( IVD5435 )
Detalles
Flujo de trabajo
Descripción general del flujo de trabajo
HiPure Circulating DNA Kit utiliza un flujo basado en columnas de sílice para purificar ADN circulante a partir de muestras de plasma y suero. Tras una lisis asistida por ARN transportador, el ADN se captura en la membrana de sílice bajo condiciones de unión optimizadas y se recupera mediante pasos de lavado, secado y elución. Este flujo proporciona un procedimiento estructurado y reproducible para la extracción rutinaria de cfDNA. Existe una variante basada en centrifugación, D3182D para laboratorios que prefieren la manipulación mediante centrifugación en lugar del procesamiento por vacío.
Lógica de procesamiento de la muestra
El flujo está diseñado para entradas de 1–5 ml de plasma o suero; la principal variación se concentra en las etapas de lisis y unión cuando se procesan volúmenes mayores. Una vez establecidas las condiciones de unión del ADN, los pasos posteriores de purificación en columna permanecen constantes, lo que favorece un rendimiento estable en condiciones rutinarias.
Características de tiempo y flujo de trabajo
En operación manual habitual, el flujo completo suele finalizar en aproximadamente 65–80 minutos, dependiendo principalmente del volumen de entrada y de las condiciones de lisis. Para consultar las condiciones paso a paso, la orientación del flujo y los tiempos estimados de procesamiento, consulte la Nota de flujo de trabajo en la sección de descargas.
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Funciones principales
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Aislamiento de ADN circulante a partir de 1–5 ml de plasma, suero y líquidos corporales mediante un protocolo de vacío
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Aplicaciones
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qPCR, análisis en chips líquidos o sólidos, hibridación, detección de SNP, etc.
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Método de purificación
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Minicolumna de centrifugación
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Tecnología de purificación
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Tecnología de sílice
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Método de procesamiento
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Manual (vacío)
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Tipo de muestra
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Suero, plasma y otras muestras líquidas libres de células
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Cantidad de muestra
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1–5 ml
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Volumen de elución
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≥50 μl
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Tiempo por ejecución
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65–80 minutos
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Volumen líquido admitido por columna
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4 ml
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Capacidad de unión de la columna
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1 mg
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Principio de extracción
HiPure Circulating DNA Kit está diseñado para purificar ADN libre de células circulante (cfDNA) a partir de muestras de plasma, suero u orina. Los ácidos nucleicos circulantes presentes en líquidos biológicos suelen encontrarse a baja concentración y, con frecuencia, como fragmentos cortos de ADN.
Las muestras se lisan con un tampón caotrópico y Proteinase K para liberar los ácidos nucleicos de los complejos proteicos y proteger el ADN frente a la degradación. Se incorpora ARN transportador para mejorar la eficiencia de recuperación de moléculas de ADN de baja abundancia.
Bajo condiciones de unión optimizadas, los fragmentos de ADN circulante se unen a la membrana de sílice de la columna HiPure cfDNA, mientras que las proteínas y otros contaminantes atraviesan la membrana durante la filtración. Después de lavados secuenciales para eliminar las impurezas residuales, el ADN purificado se eluye con un tampón de baja concentración salina adecuado para los flujos posteriores de análisis molecular.
Características de ingeniería
Arquitectura optimizada de la membrana de la columna
La evaluación interna de distintas configuraciones de membrana mostró que una estructura de sílice de tres capas ofrecía un equilibrio eficaz entre la adsorción de ADN y el tiempo de filtración durante la extracción de cfDNA.
Optimización del tampón de unión
Se desarrolló una formulación actualizada del tampón de unión (ACB) para reducir la viscosidad de la solución durante el procesamiento de plasma. Las pruebas internas mostraron que esta modificación mejoraba la eficiencia de filtración y mantenía un rendimiento comparable de recuperación de ADN.
Diseñado para el procesamiento de grandes volúmenes de plasma
El formato de columna permite procesar muestras de plasma a escala de mililitros y recuperar moléculas de ADN circulante de baja abundancia, habituales en muestras clínicas de biopsia líquida.
Integración en el sistema
IVD3182 forma parte de una estructura organizada de productos para ADN circulante:
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Extracción a partir de pequeños volúmenes de plasma → (D3180)
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Flujo estándar de 1 ml → (D3181)
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Procesamiento por centrifugación → (D3182D)
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Flujo magnético escalable → (IVD5435)
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Flujos de selección de fragmentos → (12927)
Validación técnica
Se realizaron experimentos de validación para evaluar la eficiencia de recuperación y la reproducibilidad del sistema de purificación.
Pruebas de recuperación de ADN corto
Los ensayos de recuperación con marcadores mostraron eficiencias de recuperación de ADN generalmente superiores al 80%, lo que confirma una captura eficaz de las moléculas de ADN fragmentado características de los ácidos nucleicos circulantes.
Pruebas de uniformidad entre lotes
Las verificaciones entre lotes mostraron una recuperación estable de ADN en diferentes lotes de producción, con tasas de recuperación sistemáticamente superiores al 80% y una variación mínima entre los lotes evaluados.
Validación con muestras de orina
Los experimentos de extracción de orina con fragmentos cortos de ADN añadidos mostraron eficiencias de recuperación normalmente comprendidas entre 84% y 102% bajo condiciones optimizadas de extracción.
Validación con muestras de clientes
El rendimiento se evaluó además con 46 muestras de plasma de clientes procesadas con HiPure Circulating DNA Kit bajo condiciones rutinarias en una empresa líder de análisis oncológicos. De estas muestras, 45 se clasificaron como aptas y 1 como muestra de riesgo, lo que indica un rendimiento estable de extracción con entradas de muestras reales.
Los volúmenes de entrada oscilaron entre 3,0 y 6,5 ml, y la mayoría de los flujos se concentraron en aproximadamente 4,5–5,0 ml de plasma. Estos resultados respaldan la idoneidad del sistema para extraer ADN circulante a partir de volúmenes de plasma clínicamente relevantes.
Recuperación según el tamaño de los fragmentos
Las moléculas de ADN libre de células circulante suelen estar fragmentadas y a menudo se sitúan dentro del intervalo de tamaño del ADN nucleosómico.
Los experimentos de recuperación con marcadores cortos de ADN confirmaron que el sistema de purificación puede capturar fragmentos de aproximadamente 50 pb con eficiencias de recuperación superiores al 80%.
El análisis del ADN circulante extraído de muestras de suero mostró distribuciones de fragmentos normalmente comprendidas entre aproximadamente 150 y 1000 pb, de acuerdo con las características descritas para el cfDNA.
Estos resultados indican que la química de purificación permite recuperar ADN circulante fragmentado adecuado para los análisis moleculares posteriores.
Comparación de rendimiento
Se realizaron experimentos comparativos de extracción con muestras de plasma procesadas mediante HiPure Circulating DNA Kit y un sistema comercial de extracción de cfDNA ampliamente utilizado.
En las pruebas con muestras de plasma de 5 ml, la cuantificación por Qubit indicó que las concentraciones de ADN obtenidas con el sistema HiPure fueron comparables o superiores a las obtenidas con el kit de referencia en columna en varias réplicas.
Los experimentos posteriores de preparación de bibliotecas demostraron que el ADN extraído era compatible con los flujos de ligación de adaptadores y amplificación por PCR utilizados para construir bibliotecas de secuenciación.
Resumen de escenarios de aplicación
La siguiente tabla resume escenarios de investigación publicados en los que se utilizaron IVD3182 o formatos HiPure estrechamente relacionados para la preparación de cfDNA/ctDNA. Su finalidad es ayudar a comprender las aplicaciones habituales de esta ruta antes de consultar las notas técnicas y publicaciones relacionadas.
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Escenario de aplicación
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Formato relacionado
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Muestra/fuente de cfDNA
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Uso posterior en investigación
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Perfilado de ctDNA en CPNM avanzado para investigar alteraciones genómicas asociadas a metástasis cerebral y la concordancia tejido-plasma
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D3182C
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ctDNA derivado de plasma de pacientes con CPNM avanzado, con o sin metástasis cerebral
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NGS dirigido de 95 genes para perfilar mutaciones somáticas, comparar alteraciones asociadas a metástasis cerebral, analizar la concordancia tejido-plasma y evaluar alteraciones accionables
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Comparación de ctDNA y ADN tisular en CPNM para perfilar alteraciones accionables e investigar la respuesta a EGFR-TKI
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D3182C
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ctDNA derivado de plasma de pacientes con CPNM, comparado con ADN del tejido tumoral
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NGS dirigido de 95 genes para analizar la concordancia de mutaciones entre tejido y plasma, comparar los subtipos LUAD/LUSC, evaluar alteraciones accionables e investigar su asociación con la respuesta a EGFR-TKI
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Ver más escenarios de aplicación
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Escenario de aplicación
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Formato relacionado
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Muestra/fuente de cfDNA
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Uso posterior en investigación
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Monitorización dinámica de ctDNA en CPNM avanzado ALK positivo para evaluar la respuesta a lorlatinib y perfilar resistencias adquiridas
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D3182
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ctDNA plasmático seriado de pacientes con CPNM avanzado ALK positivo durante el tratamiento con lorlatinib
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NGS dirigido de 556 genes para monitorizar de forma seriada la VAF del ctDNA, evaluar la respuesta a lorlatinib y perfilar mutaciones de resistencia adquirida en ALK
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Biopsia líquida de cfDNA en AITL para perfilar mutaciones, estratificar el pronóstico e investigar posibles biomarcadores de respuesta a PD-1
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D3182
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cfDNA de sangre periférica previo al tratamiento de pacientes con AITL de nuevo diagnóstico, junto con ADN tumoral emparejado
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NGS dirigido personalizado de 46 genes para analizar la concordancia cfDNA-tejido, identificar mutaciones recurrentes e investigar biomarcadores de pronóstico o de respuesta a PD-1
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Predicción de recurrencia posoperatoria mediante ctDNA en pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal tras hepatectomía
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D3182D
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cfDNA/ctDNA procedente de 3–5 ml de plasma posoperatorio de pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal
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NGS dirigido ultraprofundizado con UMI de doble índice y panel J25 específico para detectar ctDNA posoperatorio, predecir recurrencia y estratificar la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global
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Descubrimiento de marcadores de metilación de cfDNA plasmático en cáncer epitelial de ovario para desarrollar un modelo de detección precoz
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D3182
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cfDNA plasmático de pacientes con cáncer epitelial de ovario y controles femeninos sanos
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Cribado de marcadores de metilación de cfDNA, desarrollo de un modelo diagnóstico basado en MethylBERT, análisis pronóstico y adaptación del ensayo OV1 a ddPCR
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Validación de la metilación de MYO1-G en ctDNA de cáncer colorrectal para diagnóstico, evaluación de carga tumoral y monitorización de la respuesta al tratamiento
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D3182
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cfDNA plasmático de pacientes con cáncer colorrectal y controles sin tumor
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Ensayo de metilación MYO1-G basado en ddPCR para diagnóstico, evaluación de carga tumoral, seguimiento posquirúrgico y monitorización de la respuesta terapéutica
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Análisis de perfiles de escisión de cfDNA orientado a MCED para predecir el estado de metilación mediante WGS
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D3182S
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cfDNA procedente de 3 ml de plasma de individuos sanos y pacientes con carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón o cáncer colorrectal
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Comparación WGS/WGBS y modelado con XGBoost para predecir el estado de metilación de CpG individuales a partir de perfiles de escisión de cfDNA y desarrollar biomarcadores de MCED
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Detección y monitorización de carcinoma hepatocelular relacionado con VHB mediante perfiles de fragmentación de cfDNA plasmático
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D3182S
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cfDNA procedente de 3 ml de plasma de individuos sanos y pacientes con hepatitis B, cirrosis o carcinoma hepatocelular relacionado con VHB
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WGS de baja cobertura y análisis mediante aprendizaje automático de perfiles de fragmentación de cfDNA para detectar carcinoma hepatocelular asociado a VHB, caracterizar el estadio de la enfermedad y evaluar aspectos relacionados con la recaída
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Análisis de la fracción alélica en cfDNA de plasma materno para mejorar la precisión del NIPT de trastornos monogénicos
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D3182
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cfDNA de plasma materno de embarazadas con riesgo de trastornos monogénicos fetales
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Secuenciación profunda dirigida con indexación dual única para reducir la contaminación por amplicones quiméricos y mejorar la medición de la fracción alélica fetal en el análisis de herencia y mutaciones de novo de TSC y síndrome de Marfan
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Comparación entre evDNA y cfDNA de plasma materno en una investigación de prueba de concepto sobre enfermedades genéticas prenatales
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D3180
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evDNA procedente de vesículas extracelulares de plasma materno y cfDNA plasmático emparejado obtenido de 250 μl de plasma materno
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qPCR, WGS paired-end de baja cobertura y secuenciación dirigida de amplicones de FGFR3 para comparar evDNA y cfDNA y evaluar una prueba de concepto para detectar sexo fetal, trisomías 21/18/13 y mutaciones de novo en FGFR3
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Nota: estos ejemplos describen usos publicados de IVD3182 o de formatos HiPure de ADN circulante estrechamente relacionados para la preparación previa de cfDNA/ctDNA. El flujo de extracción proporciona ácidos nucleicos purificados para los ensayos posteriores; las conclusiones finales dependen del diseño completo del estudio, del método de secuenciación o detección, del análisis bioinformático y de la estrategia de validación clínica.
Kit Contents
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Contents
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IVD3182
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Purification Times
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50
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Buffer ACL
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250 ml
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Buffer ACB*
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300 ml
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Buffer DCW1*
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22 ml
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Buffer DCW2*
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10 ml
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Proteinase K
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540 mg
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Protease Dissolve Buffer
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30 ml
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Carrier RNA
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110 μg
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Nuclease Free Water
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20 ml
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HiPure CFDNA Mini Columns
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50
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2 ml Collection Tubes
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100
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Extender Tube
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50
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Vac-Connector
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50
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Storage and Stability
Proteinase K, Carrier RNA should be stored at 2-8°C upon arrival. However, short-term storage (up to 12 weeks) at room temperature (15-25°C) does not affect their performance. The remaining kit components can be stored dry at room temperature (15-25°C) and are stable for at least 18 months under these conditions. The entire kit can be stored at 2-8°C, but in this case buffers should be redissolved before use. Make sure that all buffers are at room temperature when used.
Experiment Data
Guía de Compra
Para seleccionar el sistema de extracción de ADN más adecuado según el tipo de muestra, el volumen de entrada y los requisitos del flujo de trabajo:
👉 Guía de selección de kits Magen
Para consultar una visión técnica más amplia de las rutas de trabajo de cfDNA, la lógica de procesamiento y la orientación de las aplicaciones posteriores:
👉 Flujos de extracción y enriquecimiento de cfDNA
Para revisar la estructura de referencia y la lógica comparativa de procesamiento de flujos representativos de cfDNA y ácidos nucleicos circulantes:
👉 Notas de flujo de trabajo de cfDNA
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IVD3182 — flujo de extracción de cfDNA en columna para entradas rutinarias de 1–5 ml de plasma o suero.
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IVD5435 — flujo de extracción de cfDNA con perlas magnéticas para el procesamiento escalable de grandes volúmenes de plasma o suero.
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12927 — flujo de enriquecimiento de fragmentos para recuperar fracciones cortas de cfDNA y reducir el fondo de fragmentos largos.
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R4316 — flujo en columna para ADN/ARN circulante y ARN/microARN, con captura de gran volumen seguida de concentración en Micro Column.
Notas de aplicación relacionadas con cfDNA: estas notas ayudan a explicar cómo se integra esta ruta de extracción de ADN circulante en distintos flujos de investigación de cfDNA plasmático y en los requisitos de los ensayos posteriores.
👉 Mapa de aplicaciones · ctDNA en oncología · Biomarcadores de metilación
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