Introducción
La proteinasa K es una serinproteasa estable con una amplia especificidad de sustrato. Puede degradar numerosas proteínas en estado nativo, incluso en presencia de detergentes. Su actividad no depende de iones metálicos y no se ve inhibida por agentes quelantes, como el EDTA, reactivos sulfhidrilo ni inhibidores de la tripsina o la quimotripsina. Es estable en un amplio intervalo de pH (4–12,5), con una actividad óptima entre pH 6,5 y 9,5. Su actividad puede potenciarse mediante la adición de agentes desnaturalizantes, como SDS y urea. La enzima se desnaturaliza rápidamente a temperaturas superiores a 70 °C. Su autólisis aumenta en condiciones de pH alcalino; sin embargo, este proceso no inactiva por completo la proteinasa K. Algunos fragmentos enzimáticos conservan plenamente su actividad proteolítica incluso después de una autólisis extensa.
La proteinasa K se utiliza con frecuencia en aplicaciones de biología molecular para digerir proteínas no deseadas, como las nucleasas presentes durante la preparación de ADN o ARN a partir de microorganismos, células cultivadas y plantas. En la preparación de ácidos nucleicos, la enzima se utiliza normalmente a una concentración de 50–200 µg/mL, a pH 7,5–8,0 y a una temperatura de 37–55 °C. Los tiempos de incubación pueden variar entre 30 minutos y 18 horas.
Para conocer flujos de trabajo completos de extracción que utilizan proteinasa K durante la lisis de las muestras y la digestión de proteínas, consulte los sistemas Magen de extracción de ADN y ARN para muestras de tejido, sangre y muestras virales y patógenas.
Detalles
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Peso molecular
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29,3 kDa
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Punto isoeléctrico
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8,9
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Aspecto
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Polvo liofilizado blanco
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Pureza
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95 % (análisis mediante SDS-PAGE)
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Actividad específica
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≥34 U/mg de proteína
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Características de temperatura
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El intervalo de temperatura con actividad efectiva es de 37–70 °C. La actividad enzimática a 65 °C es dos veces superior a la observada a 25 °C.
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Características de pH
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Intervalo de pH: 4,0–12,0; intervalo óptimo: pH 7,5–11,5.
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Condiciones de conservación
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Se recomienda conservar el producto a −20 °C para garantizar la máxima estabilidad de su actividad. El transporte o la conservación a temperatura ambiente no reducen la actividad enzimática.
La vida útil es de hasta 3 años a −20 °C y de 2 años a 2–8 °C.
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Modo de uso
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Prepare una solución a una concentración de 20 mg/mL. Añada la proteinasa K a la solución de digestión o al lisado hasta alcanzar una concentración final de 50–200 µg/mL e incube a 55–70 °C.
Después de la reacción, la proteinasa K puede eliminarse o inactivarse mediante purificación con perlas magnéticas, purificación en columna o extracción con fenol-cloroform. También puede inactivarse mediante incubación a 95 °C durante 3 minutos o a 70 °C durante 15 minutos.
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Detección de residuos de ácidos nucleicos
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No se detectaron ácidos nucleicos mediante Qubit.
No se detectó contaminación por ADN humano mediante PCR en tiempo real.
No se detectó contaminación por ADN bacteriano mediante PCR con cebadores universales para 16S (30 ciclos).
No se detectó contaminación por ADN fúngico mediante PCR con cebadores para ITS.
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Detección de nucleasas
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DNasa no detectada
RNasa no detectada
Nicasa no detectada
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Aplicaciones recomendadas
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Extracción de ácidos nucleicos, extracción de ADN circulante y extracción de ácidos nucleicos virales
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Ventajas
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Sin RNasa, DNasa ni nicasa detectables
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Sin residuos detectables de ácidos nucleicos (no detectados mediante Qubit tras analizar la totalidad de una muestra de 100 mg de Proteinase K)
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Sin contaminación detectable por ADN humano (no detectada mediante qPCR)
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Sin contaminación detectable por ADN bacteriano (no detectada mediante PCR con cebadores universales para 16S)
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Sin contaminación detectable por ADN fúngico (no detectada mediante PCR con cebadores universales para ITS)
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Puede transportarse a temperatura ambiente y mantiene una vida útil de dos años en estado seco.
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Adecuada para la extracción de ADN libre circulante de alta sensibilidad, ácidos nucleicos virales, ADN de sangre total y otras aplicaciones.
Validación técnica
Magen Proteinase K fue validada en cuanto a actividad enzimática, pureza y estabilidad a largo plazo. El polvo liofilizado presentó una actividad específica de aproximadamente 38 U/mg en el lote evaluado, cumpliendo la especificación de liberación de no menos de 33,5 U/mg. El seguimiento de la actividad a largo plazo mostró que la enzima conservó aproximadamente entre el 97,6 % y el 98,7 % de su actividad durante más de tres años en las condiciones de conservación evaluadas.
La validación funcional se realizó mediante flujos de trabajo de extracción de ADN de sangre y digestión de tejidos. En la extracción de ADN de sangre porcina, Magen Proteinase K proporcionó perfiles de rendimiento y pureza del ADN comparables a los obtenidos con productos de proteinasa K de referencia. La recuperación de ADN aumentó a medida que se incrementó la cantidad de proteinasa K utilizada. En los ensayos de digestión de tejido muscular, Magen Proteinase K permitió una lisis eficiente del tejido y la posterior recuperación de ADN genómico.
También se evaluó la compatibilidad del producto con la extracción de ácidos nucleicos. En los flujos de trabajo de extracción de ácidos nucleicos virales, el tratamiento con proteinasa K mejoró el rendimiento de la extracción, especialmente en muestras de virus de ADN difíciles de lisar, como el VHB. Estos resultados respaldan el uso de Magen Proteinase K en la extracción de ADN genómico, el aislamiento de ácidos nucleicos virales, los flujos de trabajo de ADN circulante y las aplicaciones rutinarias de lisis de muestras.
Ordering information
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Contents
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C12100
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C12101
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C12102
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PDB-1000
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Proteinase K, Lyophilizate, >30 units/mg of protein
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1 g
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10 g
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100 g
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Buffer PDB (20mM Tris, pH 7.5, 10mM CaCl2, 50% glycerol, 0.1% Preservatives)
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1000 ml
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