Introducción
La proteinasa K es una serinproteasa estable con una amplia especificidad de sustrato. Degrada numerosas proteínas en estado nativo, incluso en presencia de detergentes. Su actividad no depende de iones metálicos y no se ve afectada por agentes quelantes, como el EDTA, reactivos sulfhidrilo ni inhibidores de la tripsina o la quimotripsina. Es estable en un amplio intervalo de pH (4–12,5), con una actividad óptima entre pH 6,5 y 9,5. Su actividad puede potenciarse mediante la adición de agentes desnaturalizantes, como SDS y urea. La enzima se desnaturaliza rápidamente a temperaturas superiores a 70 °C. La autólisis de la enzima aumenta a pH alcalino; sin embargo, este proceso no inactiva por completo la proteinasa K. Algunos fragmentos enzimáticos conservan plenamente su actividad proteolítica incluso después de una autólisis extensa.
La proteinasa K se utiliza con frecuencia en aplicaciones de biología molecular para digerir proteínas no deseadas, como las nucleasas presentes durante la preparación de ADN o ARN a partir de microorganismos, células cultivadas y plantas. En la preparación de ácidos nucleicos, la enzima se utiliza normalmente a una concentración de 50–200 µg/mL, a pH 7,5–8,0 y a una temperatura de 37–55 °C. Los tiempos de incubación pueden variar entre 30 minutos y 18 horas.
Para conocer flujos de trabajo completos de extracción que utilizan proteinasa K durante la lisis de las muestras y la digestión de proteínas, consulte los sistemas Magen de extracción de ADN y ARN para muestras de tejido, sangre y muestras virales y patógenas.
Detalles
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Peso molecular
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29,3 kDa
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Punto isoeléctrico
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8,9
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Pureza
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95 % (análisis mediante SDS-PAGE)
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Actividad específica
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≥600 U/mL
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Características de temperatura
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Temperatura de máxima actividad: 70 °C; intervalo de temperatura con actividad efectiva: 37–70 °C.
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Características de pH
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Intervalo de pH: 4,0–12,0; intervalo óptimo: pH 7,5–11,5. Mantiene su actividad en la solución de digestión a 65 °C.
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Condiciones de conservación
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Se recomienda conservar el producto a baja temperatura para garantizar la máxima estabilidad de su actividad. El transporte o la conservación a temperatura ambiente no reducen la actividad enzimática.
La vida útil a temperatura ambiente es de hasta 1 año.
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Modo de uso
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Añada la proteinasa K a la solución de digestión o al lisado hasta alcanzar una concentración final de 50–200 µg/mL e incube a 55–70 °C. Después de la reacción, la proteinasa K puede eliminarse o inactivarse mediante purificación con perlas magnéticas, purificación en columna o extracción con fenol-cloroform. También puede inactivarse mediante incubación a 95 °C durante 3 minutos o a 70 °C durante 15 minutos.
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Detección de residuos de ácidos nucleicos
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Cuantificación mediante Qubit: ≤1 ppm.
Sin contaminación detectable por ADN humano mediante PCR en tiempo real.
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Detección de nucleasas
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DNasa no detectada
RNasa no detectada
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Aplicaciones recomendadas
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Extracción de ADN de tejidos y células y aislamiento de ácidos nucleicos virales
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Validación técnica
Magen Proteinase K Solution fue validada como una preparación enzimática lista para usar a una concentración de 20 mg/mL para flujos de trabajo de extracción de ácidos nucleicos. Las especificaciones del producto indican una elevada pureza determinada mediante SDS-PAGE, ausencia de actividad DNasa o RNasa detectable y ausencia de contaminación detectable por ADN humano mediante PCR en tiempo real en las condiciones evaluadas.
Los ensayos funcionales a largo plazo mostraron que la Proteinase K líquida, conservada a temperatura ambiente durante un año, presentó un rendimiento comparable al de la Proteinase K recién preparada en la digestión de músculo de pollo, la extracción de ADN de sangre total mediante perlas magnéticas y la extracción de ADN del VHB mediante columnas. No se observaron diferencias evidentes en el rendimiento, la pureza ni el desempeño de amplificación del ADN entre la enzima líquida conservada y el control recién preparado.
Los ensayos adicionales de estabilidad de la Proteinase K líquida mostraron una actividad enzimática estable durante un periodo de seguimiento de dos años, manteniéndose en aproximadamente 680 U/mL en todos los puntos temporales evaluados. Estos resultados respaldan el uso de Magen Proteinase K Solution para la manipulación rutinaria a temperatura ambiente, la extracción de ácidos nucleicos virales, la extracción de ADN de tejidos y células y los flujos de trabajo automatizados o manuales de preparación de muestras.
Ordering information
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Contents
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C12103
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C12104
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Proteinase K Solution (20mg/ml)
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10 ml
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1000 ml
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