Introducción
La RNasa A es una endorribonucleasa que degrada específicamente el ARN monocatenario en los residuos de citidina (C) y uridina (U). Cataliza la escisión de los enlaces fosfodiéster adyacentes a nucleótidos de pirimidina. El fosfato cíclico 2′,3′ resultante se hidroliza posteriormente para formar el correspondiente nucleótido 3′-fosfato. La máxima actividad se observa con ARN monocatenario. La RNasa A es un polipéptido de cadena única que contiene cuatro puentes disulfuro.
Una de las principales aplicaciones de la RNasa A es la eliminación de ARN en preparaciones de ADN plasmídico. La enzima mantiene su actividad en una amplia variedad de condiciones de reacción. A bajas concentraciones salinas (0–100 mM de NaCl), la RNasa A degrada ARN monocatenario y bicatenario, así como la cadena de ARN de los híbridos ARN-ADN. Sin embargo, a concentraciones de NaCl de 0,3 M o superiores, la RNasa A degrada específicamente el ARN monocatenario.
Para conocer flujos de trabajo de purificación de ADN que requieren la eliminación de ARN, consulte los sistemas Magen de extracción de ADN genómico y ADN plasmídico mediante purificación en columna o con perlas magnéticas.
Detalles
Especificaciones
|
Características
|
Especificaciones
|
|
Aspecto
|
Polvo liofilizado blanco o amarillo claro
|
|
Peso molecular
|
13,7 kDa
|
|
Pureza
|
≥60 % de RNasa A (SDS-PAGE)
|
|
Actividad específica
|
>50 unidades Kunitz/mg de proteína
|
|
Condiciones de conservación
|
Conservar entre −20 y 8 °C. La RNasa A es estable en condiciones de calentamiento y en presencia de detergentes, y puede soportar tratamientos a temperaturas de hasta 100 °C.
|
|
Detección de DNasa residual
|
No detectada. Se añadió RNasa A a una solución de 10 µL que contenía 200 ng de plásmido hasta alcanzar una concentración final de 50–100 µg/mL y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la electroforesis, la banda principal permaneció claramente visible y no presentó degradación.
|
Aplicación
|
Eliminación de ARN en preparaciones de ADN plasmídico
|
Validación técnica
Magen RNase A fue validada para comprobar la ausencia de actividad DNasa utilizando ADN plasmídico purificado. Tras la incubación con RNasa A a concentraciones finales de 100 µg/mL y 250 µg/mL durante 30 minutos a temperatura ambiente, la electroforesis en gel de agarosa mostró bandas claras de ADN plasmídico sin degradación visible, lo que indica que no se detectó contaminación por DNasa en las condiciones evaluadas.
La eliminación funcional del ARN se evaluó durante la extracción de ADN plasmídico utilizando cultivos bacterianos frescos y el flujo de trabajo de minipreparación de plásmidos P1001. Magen RNase A mostró un rendimiento de digestión del ARN comparable al de Sigma RNase A. A una concentración de 100 µg/mL, la contaminación por ARN se eliminó eficazmente de las preparaciones de ADN plasmídico, mientras que a concentraciones inferiores se observó ARN residual en las condiciones evaluadas.
El rendimiento de la RNasa A también se evaluó durante la extracción de ADN de tejidos utilizando muestras frescas de hígado porcino y el flujo de trabajo en columna D3121. Tras la digestión del tejido con proteinasa K, la adición de RNasa A eliminó eficazmente la contaminación por ARN en el sistema de digestión que contenía SDS. Se observó una eliminación eficaz del ARN a una concentración de 100 µg/mL, y el ADN extraído presentó bandas claras mediante electroforesis en gel de agarosa.
Los ensayos de estabilidad a largo plazo mostraron que la solución de RNasa A conservada a temperatura ambiente durante uno o dos meses mantuvo su actividad de digestión del ARN en los flujos de trabajo de extracción de ADN plasmídico y ADN de tejidos. Los ensayos adicionales mostraron que la adición de RNasa A no redujo la recuperación de ADN ni provocó una degradación visible, lo que respalda su uso para eliminar ARN durante la purificación de ADN plasmídico y ADN genómico.
Ordering information
|
Contents
|
C12120
|
C12121
|
|
RNase A, Lyophilizate, >50 U/mg of protein
|
1 g
|
10 g
|
Storage and Stability
Magen recommends storage at -20-8°C. When stored at 2-8°C, the product retains activity for at least 2 years.
