Detalles
Flujo de trabajo
Descripción general del flujo de trabajo
El HiPure Universal miRNA Kit combina la lisis con MagZol y la separación de fases con la posterior purificación del ARN mediante columnas de sílice. Las muestras se lisan con MagZol Reagent y la fase acuosa que contiene el ARN se recupera tras la separación de fases asistida por cloroformo. A continuación, la fase acuosa recuperada puede procesarse para obtener ARN total, incluido el miRNA, o bien separarse en una fracción de ARN de mayor tamaño y otra enriquecida en miRNA mediante la unión secuencial a columnas de sílice controlada por la concentración de alcohol.
Principios de manipulación de las muestras
Este flujo de trabajo está diseñado para células cultivadas y muestras de tejido, incluidas aquellas que requieren una disgregación más intensa basada en fenol/guanidina y una reducción inicial de la complejidad de la matriz. La separación de fases con MagZol permite recuperar el ARN en la fase acuosa y reducir la presencia de proteínas, lípidos y ADN antes de la purificación en columna. Tras esta separación inicial, la ruta posterior determina si el ARN total, incluido el miRNA, se recupera conjuntamente o si las fracciones de ARN grande y ARN pequeño se recogen por separado.
Duración y características del flujo de trabajo
En condiciones habituales de procesamiento manual, el flujo de trabajo suele completarse en aproximadamente 40–70 minutos, dependiendo principalmente de la calidad de la homogeneización, la manipulación durante la separación de fases y de si se prepara ARN total o fracciones de ARN separadas. Este procedimiento requiere más etapas que un método directo en columna, pero proporciona una lisis inicial más intensa y permite recuperar de forma flexible ARN total o fracciones enriquecidas en miRNA. Para consultar las condiciones detalladas de cada paso, las recomendaciones del procedimiento y los tiempos de procesamiento estimados, consulte la Nota del flujo de trabajo disponible en la sección de Descargas.
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Funciones principales
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Aislamiento de miRNA y otras moléculas de ARN pequeño (18 nt) a partir de células cultivadas y distintos tejidos animales y humanos mediante MagZol Reagent y columnas
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Aplicaciones
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RT-PCR, Northern blot, purificación de ARN poli(A)+, protección de ácidos nucleicos y traducción in vitro
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Método de purificación
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Minicolumna de centrifugación
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Tecnología de purificación
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Tecnología de sílice
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Método de procesamiento
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Manual (centrifugación o vacío)
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Tipo de muestra
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Tejidos animales, células adherentes, células en suspensión, bacterias, etc.
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Cantidad de muestra
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Células eucariotas cultivadas: ≤10^7; tejido animal: <100 mg; células de levadura cultivadas: <5 × 10^7; bacterias: <10^9
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Volumen de elución
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≥15 µl
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Tiempo por procesamiento
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Aprox. 40–70 minutos
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Capacidad de carga de líquido por columna
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800 µl
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Capacidad de unión de la columna
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100 µg
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Principio de extracción
El kit combina la lisis basada en fenol/guanidina con la purificación mediante membranas de sílice para permitir el aislamiento eficaz de ARN total y el enriquecimiento de ARN pequeños, incluido el miRNA. Durante la lisis, MagZol Reagent disgrega las células y los tejidos, a la vez que desnaturaliza las proteínas y las RNasas para preservar la integridad del ARN. La posterior extracción con cloroformo transfiere el ARN a la fase acuosa y elimina proteínas, lípidos y la mayor parte del ADN genómico.
A continuación, el ARN se purifica mediante su adsorción a una membrana de sílice en condiciones de unión controladas por la concentración de etanol. Cuando se utiliza una concentración elevada de etanol, tanto las moléculas de ARN grandes como las pequeñas se unen a la membrana, lo que permite recuperar ARN total, incluido el miRNA. Con una concentración de etanol más baja, las moléculas de ARN de mayor tamaño se unen preferentemente a la primera columna, mientras que los ARN pequeños permanecen en el líquido filtrado. Tras aumentar la concentración de etanol, estos ARN pequeños se unen a una segunda columna, lo que permite aislar una fracción enriquecida en miRNA y conservar simultáneamente la fracción de ARN de mayor tamaño para su purificación en paralelo.
Características técnicas
Química de estabilización del ARN basada en fenol/guanidina
MagZol Reagent lisa rápidamente las células y los tejidos y desnaturaliza las RNasas, preservando la integridad del ARN y evitando la degradación de las moléculas de ARN pequeño durante la extracción.
Selección del tamaño del ARN controlada mediante etanol
Las diferentes concentraciones de etanol regulan la adsorción del ARN a las membranas de sílice, lo que permite enriquecer selectivamente las fracciones de ARN pequeño mientras las moléculas de ARN de mayor tamaño se capturan por separado.
Recuperación eficaz de ARN pequeños reguladores
La química de extracción y las condiciones de unión están optimizadas para recuperar eficazmente miRNA y otros ARN pequeños reguladores que suelen perderse durante los procedimientos convencionales de purificación de ARN.
Validación técnica
El HiPure Universal miRNA Kit se evaluó como un flujo de trabajo basado en lisis con fenol/guanidina mediante MagZol y purificación en columnas de sílice para recuperar ARN total, incluidos miRNA y otras moléculas de ARN pequeño.
La recuperación de ARN pequeño se evaluó inicialmente utilizando muestras de 50 mg de tejidos de pollo, incluidos hígado, riñón, bazo, corazón, músculo y pulmón. A partir de 50 mg de hígado, la fracción de ARN pequeño enriquecida en miRNA presentó un rendimiento de 26,0–29,3 µg, con valores de A260/280 de 1,88–2,04. Los demás tejidos analizados produjeron rendimientos de ARN pequeño de 8,4–19,2 µg en las condiciones evaluadas. El análisis mediante electroforesis en gel de agarosa al 3 % mostró que la fracción enriquecida en ARN pequeño se localizaba principalmente por debajo de la región del marcador de 50 pb, sin observarse una contaminación evidente por ARN de mayor tamaño en los carriles analizados.
La fracción de ARN de mayor tamaño también se recuperó mediante el mismo flujo de trabajo aplicado a los tejidos animales. A partir de 50 mg de hígado de pollo, se obtuvieron rendimientos de ARN grande de 169,2–181,5 µg, con valores de A260/280 de 2,07–2,11 y valores de A260/230 de 1,94–1,98. Con 50 mg de riñón y bazo, se obtuvieron rendimientos de ARN grande de 103,7–103,9 µg y 127,6–127,7 µg, respectivamente. Los tejidos con menor rendimiento, como el músculo y el pulmón, produjeron respectivamente 6,7–11,2 µg y 32,4–34,8 µg de ARN, manteniendo en general relaciones de absorbancia aceptables en las condiciones evaluadas.
La compatibilidad con muestras vegetales se evaluó utilizando 100 mg de hojas de soja, maíz y arroz. La fracción de ARN pequeño enriquecida en miRNA presentó rendimientos de 14,2–16,1 µg con hojas de soja, 9,7–10,7 µg con hojas de maíz y 1,9–2,2 µg con hojas de arroz. Los valores de A260/280 variaron según el tipo de planta, especialmente en las fracciones de ARN pequeño de soja y maíz, lo que indica diferencias de pureza dependientes de la matriz en las muestras vegetales. El análisis en gel siguió mostrando un enriquecimiento de ARN pequeño principalmente por debajo de la región de 50 pb, lo que respalda la recuperación de ARN pequeño a partir de material vegetal en las condiciones evaluadas.
La recuperación de ARN grande a partir de muestras vegetales se evaluó adicionalmente utilizando las mismas entradas de 100 mg. Con hojas de soja, la fracción de ARN de mayor tamaño presentó un rendimiento de 72,34–81,02 µg, con valores de A260/280 de 2,19–2,20. Las hojas de maíz y arroz produjeron rendimientos de ARN grande de 9,94–12,40 µg y 13,38–14,58 µg, respectivamente, con valores de A260/280 de aproximadamente 2,06–2,12. El análisis electroforético mostró patrones claramente definidos de bandas de ARN de mayor tamaño, con poca presencia visible de fragmentos pequeños residuales, lo que respalda la recuperación fraccionada de ARN grande tras la separación del ARN pequeño.
En conjunto, estos resultados respaldan el uso de R4310 como flujo de trabajo universal para la recuperación de miRNA y el fraccionamiento de ARN a partir de tejidos animales, tejidos vegetales y otras muestras biológicas en las que se requiere tanto el enriquecimiento de ARN pequeño como la recuperación de ARN de mayor tamaño. Los datos más sólidos corresponden al enriquecimiento de ARN pequeño y la recuperación de ARN grande a partir de tejidos animales, mientras que los resultados de ARN pequeño en muestras vegetales deben interpretarse teniendo en cuenta la presencia de inhibidores y pigmentos específicos de cada muestra.
Comparación del rendimiento
En comparación con los sistemas convencionales de purificación de ARN diseñados principalmente para ARN de mayor tamaño (>200 nt), el Universal miRNA Kit permite mejorar la recuperación de moléculas de ARN pequeño mediante la unión controlada por la concentración de etanol y la purificación secuencial en columnas de sílice.
Entre sus principales ventajas se incluyen:
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Enriquecimiento eficaz de las fracciones de ARN pequeño, incluido el miRNA
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Recuperación simultánea de ARN grande (>200 nt) para su análisis en paralelo
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Menor pérdida de moléculas de ARN regulador durante la purificación
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Pureza y rendimiento del ARN comparables a los obtenidos con sistemas comerciales de extracción ampliamente utilizados
Estas características hacen que el sistema sea adecuado para aplicaciones que requieren una recuperación fiable de ARN reguladores.
Resumen de las aplicaciones
R4310 está diseñado para la recuperación de ARN total, incluido el ARN pequeño, mediante MagZol, así como para flujos de trabajo en los que el miRNA y otros ARN no codificantes constituyen objetivos importantes. En comparación con la extracción rutinaria de ARN total, este método resulta más adecuado para estudios que requieren la recuperación compatible con ARN pequeños y el análisis de miRNA, lncRNA o mecanismos reguladores asociados al ARN. Los ejemplos de investigación seleccionados a continuación incluyen la regulación mediante miRNA exosomal durante la transformación del linfoma, el análisis del transcriptoma a nivel de promotores en el carcinoma hepatocelular y la validación de una firma pronóstica de lncRNA en el cáncer de vejiga.
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Aplicación
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Origen de las muestras
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Aplicación posterior en investigación
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Regulación mediante miRNA exosomal de la transformación del linfoma folicular y del microambiente inmunitario tumoral
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Tejidos de ganglios linfáticos de linfoma folicular y DLBCL, líneas celulares de linfoma, muestras de miRNA asociado a exosomas y sistemas de cocultivo con macrófagos
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Extracción de miRNA y análisis mediante RT-qPCR de miR-7e-5p para investigar cómo la disminución de miR-7e-5p impulsada por c-MYC reduce la transferencia de miRNA exosomal, aumenta la expresión de FasL en los macrófagos y favorece la remodelación inmunosupresora del estroma durante la transformación del linfoma folicular.
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Análisis del uso de promotores alternativos y del transcriptoma regulado por la metilación del ADN en el carcinoma hepatocelular
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Tejidos de carcinoma hepatocelular congelados en fresco y tejidos hepáticos normales adyacentes emparejados
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Extracción de ARN total para la validación mediante RNA-seq de la actividad de promotores alternativos, como apoyo al análisis de promotores alternativos regulados por metilación, la elaboración de modelos diagnósticos del carcinoma hepatocelular y los cambios del transcriptoma a nivel de promotores durante el desarrollo del cáncer.
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Validación de una firma pronóstica de lncRNA en el carcinoma urotelial de vejiga
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Muestras de tejido de carcinoma urotelial de vejiga y líneas celulares de BLCA, incluidas 5637, J82, T24 y SW780
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Extracción de ARN total para la validación mediante RT-qPCR de lncRNA pronósticos, como apoyo a la evaluación de una puntuación de riesgo basada en cuatro lncRNA y de marcadores de expresión de lncRNA asociados al cáncer en el carcinoma urotelial de vejiga.
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Kit Contents
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Contents
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R431002
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R431003
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Purification Times
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50 Preps
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250 Preps
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HiPure RNA Mini Columns
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100
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2 x 250
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2ml Collection Tubes
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100
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2 x 250
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MagZol Reagent
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60 ml
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270 ml
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Buffer RWC
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20 ml
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80 ml
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Buffer RW2*
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20 ml
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2 x 50 ml
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RNase Free Water
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10 ml
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30 ml
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Storage and Stability
MagZol Reagent should be stored at 2-8°C upon arrival. However, short-term storage (up to 24 weeks) at room temperature (15-25°C) does not affect its performance. The remaining kit components can be stored at room temperature (15-25°C) and are stable for at least 18 months under these conditions.
