Introduction
MagPure FFPE DNA/RNA Kit (R6327) representa la configuración de coextracción con perlas magnéticas dentro de la gama Magen para la purificación de ácidos nucleicos de FFPE. El sistema está diseñado para recuperar tanto ADN genómico como ARN de tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina mediante un flujo de adsorción magnética.
Después de la digestión del tejido, los ácidos nucleicos se separan según su comportamiento de unión a las perlas magnéticas, lo que permite aislar las fracciones de ADN y ARN durante la etapa de adsorción. Esta configuración favorece una recuperación eficaz de los ácidos nucleicos fragmentados habituales en muestras FFPE y está optimizada para obtener un mayor rendimiento total de ADN y ARN.
La química de las partículas magnéticas y las proporciones entre perlas y lisado se perfeccionaron mediante ciclos internos de desarrollo para mejorar la eficiencia de adsorción y la estabilidad de recuperación en distintas condiciones de tejido FFPE.
Los laboratorios que priorizan la integridad del ARN durante la extracción pueden consultar MagPure FFPE DNA/RNA Kit – IVD3026, donde la partición de los ácidos nucleicos se produce antes, durante la etapa de digestión.
Los flujos de purificación en columna están disponibles mediante HiPure FFPE DNA Kit – D3126 para la extracción de ADN genómico y HiPure FFPE RNA Kit – R4143 para la purificación de ARN.
R6327 funciona como el flujo magnético de referencia para alta recuperación dentro del sistema Magen de extracción de FFPE.
Details
Flujo de trabajo
Descripción general del flujo de trabajo
El Flujo II de coaislamiento de ADN/ARN de FFPE se basa en una estrategia de adsorción magnética secuencial. Tras el pretratamiento común y la lisis de la muestra FFPE, el ADN se captura primero mediante partículas magnéticas. El sobrenadante que contiene ARN se transfiere después a una segunda ruta de unión magnética para purificar el ARN. Este diseño de adsorción escalonada permite recuperar ADN y ARN de un mismo sistema de lisado FFPE mediante etapas secuenciales de unión magnética.
Lógica de procesamiento de la muestra
El punto central de separación de este flujo no es una división física entre sedimento y sobrenadante durante el pretratamiento inicial, sino la primera etapa de adsorción del ADN. El ADN se captura primero, mientras que el ARN permanece en el sobrenadante y se recupera posteriormente mediante una ruta magnética independiente. Esta estrategia resulta útil cuando el objetivo es recuperar eficazmente ADN y ARN de la misma muestra, especialmente para análisis paralelos o aplicaciones orientadas a la multiómica.
Características de tiempo y flujo de trabajo
En operación manual habitual, el flujo de adsorción secuencial representado por R6327 suele requerir aproximadamente 3,3–14,5 horas. El intervalo más largo se debe principalmente a la digestión dependiente del tipo de muestra antes de la unión magnética secuencial. Como el ADN y el ARN se recuperan mediante adsorción escalonada, la finalización del flujo debe evaluarse considerando el procesamiento de ambas rutas analíticas. Para consultar las condiciones paso a paso, la orientación del flujo y los tiempos estimados de procesamiento, consulte la Nota de flujo de trabajo en la sección de descargas.
Especificaciones
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Características
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Especificaciones
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Funciones principales
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Coaislamiento de ADN y ARN a partir de tejido FFPE
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Aplicaciones
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RT-PCR, síntesis de ADNc, PCR y secuenciación de nueva generación, entre otras aplicaciones
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Método de purificación
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Perlas magnéticas polidispersas basadas en sílice (ADN)
Perlas magnéticas monodispersas con grupos carbonilo (ARN)
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Tecnología de purificación
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Tecnología de perlas magnéticas
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Método de procesamiento
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Manual o automatizado
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Instrumentos compatibles
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Extractor de ácidos nucleicos y estación de pipeteo
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Tipo de muestra
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Secciones FFPE, muestras de punción FFPE y tejido incluido en parafina
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Cantidad de muestra
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No más de seis secciones de 10 µm con una superficie de 150 mm2 de superficie, o tres secciones de 20 µm con una superficie de 150 mm2 de superficie
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Rendimiento
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ADN: 1–10 μg; ARN: 1–25 μg
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Principio de extracción
La fijación con formalina genera entrecruzamientos entre los ácidos nucleicos y las proteínas, mientras que la inclusión en parafina introduce contaminantes hidrofóbicos que dificultan su recuperación. Además, los ácidos nucleicos extraídos de tejidos FFPE suelen estar fragmentados como consecuencia de la fijación y del almacenamiento prolongado.
En el flujo MagPure FFPE DNA/RNA, las secciones de tejido se desparafinizan primero y se digieren con Proteinase K para liberar los ácidos nucleicos de la matriz tisular FFPE. Se incluye una incubación a alta temperatura para revertir parcialmente los entrecruzamientos provocados por el formaldehído y mejorar la accesibilidad tanto del ADN como del ARN.
A diferencia de los flujos convencionales, en los que el ADN y el ARN se extraen por separado, MagPure FFPE DNA/RNA Kit utiliza una estrategia de adsorción magnética secuencial para aislar ambos tipos de ácidos nucleicos a partir del mismo lisado.
El ADN genómico se captura primero mediante partículas magnéticas bajo condiciones de unión optimizadas. A continuación, el sobrenadante restante que contiene ARN se transfiere a una segunda etapa de adsorción, en la que las moléculas de ARN se unen a un sistema independiente de partículas magnéticas.
Este diseño de adsorción escalonada permite recuperar eficazmente ADN y ARN a partir de una única digestión, manteniendo la compatibilidad con los ácidos nucleicos fragmentados habituales en los tejidos FFPE.
Características de ingeniería
Adsorción mediante partículas magnéticas
Las partículas magnéticas recubiertas de sílice permiten adsorber eficazmente el ADN y el ARN fragmentados que suelen estar presentes en los lisados de tejido FFPE.
Flujo de coaislamiento de ADN/ARN
El flujo permite recuperar ambos tipos de ácidos nucleicos a partir de una única digestión y facilita análisis multiómicos cuando el material de tejido FFPE es limitado.
Rendimiento de recuperación de fragmentos
Las condiciones de unión con perlas magnéticas favorecen la recuperación de fragmentos cortos y degradados de ácidos nucleicos, característicos de los tejidos fijados con formalina.
Recuperación a partir de muestras de baja entrada
Las proporciones optimizadas entre perlas y lisado mejoran la eficiencia de adsorción al procesar lisados FFPE con baja concentración de ácidos nucleicos.
Validación técnica
El rendimiento del flujo de coextracción de ADN/ARN se evaluó mediante experimentos internos de validación y datos externos obtenidos bajo condiciones rutinarias de laboratorio.
Uniformidad de recuperación y estabilidad de producción
La evaluación interna con lisados FFPE que presentaban distintas concentraciones de ácidos nucleicos mostró una recuperación uniforme entre extracciones replicadas. Paralelamente, los parámetros fisicoquímicos de las partículas magnéticas y el rendimiento de extracción se mantuvieron estables entre los lotes de producción validados, lo que respalda la reproducibilidad del flujo.
Integridad del ARN y compatibilidad con PCR
El análisis por electroforesis mostró bandas de ARN íntegras sin degradación detectable, incluso en muestras almacenadas durante la noche a 4 °C después de la extracción. Los experimentos de RT-PCR también mostraron una eficiencia de amplificación comparable entre el ARN extraído y los controles de referencia, lo que indica una eliminación eficaz de inhibidores que podrían afectar a la amplificación posterior.
Validación con muestras de clientes
Se obtuvo una validación adicional a partir de datos de pruebas rutinarias generados en un laboratorio líder de análisis oncológicos, utilizando muestras FFPE procesadas mediante el flujo de coextracción de ADN/ARN.
En este conjunto de datos se obtuvieron resultados de ADN conformes en 135 de 139 muestras y resultados de ARN conformes en 114 de 116 muestras. Estos datos muestran un rendimiento fiable de recuperación para ambos analitos en flujos rutinarios de análisis de muestras FFPE.
Las muestras evaluadas incluyeron varios tipos habituales de material FFPE, como tejido quirúrgico, muestras obtenidas por biopsia y rollos de parafina, lo que respalda la aplicabilidad del flujo a entradas habituales de los laboratorios de anatomía patológica.
Estos resultados aportan evidencia adicional de que el sistema es adecuado para flujos posteriores de análisis molecular que requieren ADN y ARN derivados de muestras clínicas FFPE archivadas.
Resumen de escenarios de aplicación
Los flujos compatibles con ADN/ARN de FFPE resultan útiles cuando una cantidad limitada de tejido archivado debe sustentar más de una línea de análisis molecular o cuando el diseño del estudio requiere flexibilidad entre análisis basados en ADN y en ARN. Los ejemplos seleccionados a continuación incluyen formatos Magen de extracción de ADN/ARN de FFPE, entre ellos IVD3026, R6327 e IVD5116.
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Escenario de aplicación
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Formato relacionado
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Fuente de la muestra
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Uso posterior en investigación
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Validación mediante RNA-NGS en CPNM FFPE de reordenamientos no canónicos de RET para el diagnóstico de fusiones
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IVD3026
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Muestras de tejido FFPE de pacientes chinos con CPNM y reordenamientos de RET
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Extracción de ARN total para RNA-NGS dirigido, confirmación funcional de transcritos de fusión de RET, validación de socios de fusión no canónicos y comparación de métodos diagnósticos mediante NGS, FISH e IHC
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Perfilado genómico del cáncer de recto con recidiva local para investigar mecanismos de recurrencia relacionados con la vía Wnt
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R6327
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Bloques de tejido FFPE de cáncer de recto primario, cáncer de recto con recidiva local, cáncer de recto sin recidiva y tejido rectal normal emparejado
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Extracción de ADN para secuenciación del exoma completo, comparación del panorama mutacional, análisis de enriquecimiento de vías específicas de la recidiva local y evaluación de genes candidatos de la vía de señalización Wnt
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Ver más escenarios de aplicación
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Escenario de aplicación
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Formato relacionado
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Fuente de la muestra
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Uso posterior en investigación
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Perfilado genómico emparejado tumor-ctDNA en CPNM avanzado para investigar la estratificación de la inmunoquimioterapia
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R6327
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ADN genómico derivado de tumor utilizado como referencia tisular emparejada en CPNM avanzado; las muestras de tejido se emparejaron con muestras de ctDNA previas al tratamiento para análisis mediante WES
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WES basado en tejido combinado con NGS dirigido de 520 genes en ctDNA plasmático y WGS de baja cobertura para apoyar el análisis de subtipos inmunogenómicos basado en ctDNA, la comparación tejido-sangre y la investigación de la estratificación del beneficio de inhibidores de PD-1
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Perfilado genómico tumoral de CPNM con mutación en EGFR para investigar la respuesta a la inmunoquimioterapia neoadyuvante y la enfermedad residual mínima
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R6327 + D6323B
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Biopsias previas al tratamiento y muestras tumorales resecadas después del tratamiento de pacientes con CPNM en estadio IIB–IIIB y mutación en EGFR
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Extracción de ADN genómico tumoral para WES, análisis de características genómicas basales y posteriores al tratamiento, diseño de paneles de enfermedad residual mínima informados por el tumor e investigación de mecanismos de respuesta y resistencia
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Investigación de inmunoquimioterapia perioperatoria y monitorización de ctDNA-MRD en carcinoma escamoso de esófago localmente avanzado
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R6327
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Muestras tumorales de biopsia endoscópica FFPE de carcinoma escamoso primario de esófago antes del tratamiento neoadyuvante con nivolumab más quimioterapia
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Extracción de ADN genómico tumoral para WES, selección de mutaciones específicas del paciente y diseño personalizado de paneles de ctDNA-MRD, como apoyo a la evaluación de la respuesta a la inmunoquimioterapia perioperatoria, la estratificación pCR/no pCR, el análisis de eliminación de ctDNA y la monitorización del riesgo de recurrencia
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Análisis de biomarcadores de ctDNA informados por el tumor en CPNM avanzado para seleccionar inmunoquimioterapia de primera línea
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R6327
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Biopsias tumorales FFPE o muestras tumorales archivadas y controles normales emparejados derivados de sangre de pacientes con CPNM avanzado de la cohorte de biomarcadores CHOICE-01
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WES de tejido combinado con secuenciación de ctDNA plasmático de 520 genes para identificar mutaciones tumorales específicas del paciente, comparar enfoques de ctDNA informados por el tumor y no informados por el tumor, y evaluar la positividad o eliminación de ctDNA como biomarcadores predictivos del beneficio de la combinación ICI-quimioterapia.
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Detección de enfermedad residual después de nCRT en carcinoma escamoso de esófago e investigación de decisiones terapéuticas para preservar el órgano
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R6327
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Muestras tumorales de biopsia endoscópica FFPE previas al tratamiento de pacientes con carcinoma escamoso de esófago localmente avanzado sometidos a quimiorradioterapia neoadyuvante
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Extracción de ADN genómico tumoral para WES y construcción de ensayos personalizados de ctDNA, como apoyo a la detección de enfermedad residual mínima después de nCRT, la integración del ctDNA con la evaluación de la respuesta clínica, la predicción de ausencia de pCR, la valoración de estrategias de preservación del órgano y la orientación de la inmunoterapia adyuvante.
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Análisis mediante RNA-seq de biomarcadores del microambiente tumoral en CPNM metastásico no escamoso en el ensayo IMpower151
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IVD5116
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Secciones de tejido tumoral FFPE de pacientes con CPNM metastásico no escamoso incluidos en el ensayo aleatorizado IMpower151
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Extracción de ARN total para RNA-seq de FFPE, análisis de firmas génicas inmunitarias y perfilado del microambiente tumoral, como apoyo a la evaluación de firmas de linfocitos T, células dendríticas, MHC y células de linaje mieloide asociadas al estado mutacional de EGFR y a la supervivencia libre de progresión bajo tratamiento con atezolizumab, bevacizumab y quimioterapia.
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Nota: los ejemplos seleccionados utilizan formatos de extracción compatibles con ADN/ARN de FFPE, pero el ácido nucleico empleado posteriormente varía según el estudio. Algunos flujos utilizan ARN de FFPE para validar transcritos de fusión, mientras que otros emplean ADN extraído con un formato compatible con ADN/ARN para WES o perfilado genómico tumoral. Estos ejemplos no deben describirse como estudios multiómicos de ADN/ARN salvo que ambos analitos se utilicen explícitamente en el mismo estudio.
Kit Contents
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Contents
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R632701
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R632702
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R632703
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Purification Times
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48 Preps
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96 Preps
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5 x 96 Preps
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MagBind Particles
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1.1 ml
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2.5 ml
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11 ml
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MagPure Particles N
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1.1 ml
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2.5 ml
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11 ml
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Proteinase K
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24 mg
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48 mg
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220 mg
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Protease Dissolve Buffer
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3 ml
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10 ml
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15 ml
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Buffer DPS
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50 ml
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100 ml
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2 x 250 ml
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Buffer ATL
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20 ml
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30 ml
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120 ml
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Buffer BST1
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20 ml
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40 ml
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200 ml
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Buffer BXW1*
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44 ml
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110 ml
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3 x 110 ml
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RNase Free Water
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15 ml
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30 ml
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120 ml
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Storage and Stability
Proteinase K, MagPure Particles N and MagBind Particles should be stored at 2–8°C upon arrival. However, short-term storage (up to 12 weeks) at room temperature (15–25°C) does not affect their performance. The remaining kit components can be stored at room temperature (15–25°C) and are stablefor at least 18 months under these conditions.
Experiment Data
